辛前甘桔汤对慢性鼻窦炎小鼠lncRNA SNHG16、EGFR及MUC5AC mRNA表达的影响

施陈燕，柳国斌，孙 茹，张治军，滕 磊，蔡蔚然，董雪林，袁 波，鞠 晗，张 弢

1.上海中医药大学附属曙光医院耳鼻喉科（上海 201203）；2.上海中医药大学附属曙光医院血管外科（上海 201203）

全球慢性鼻窦炎（chronic rhinosinusitis，CRS）的患病率呈逐年上升趋势。欧洲CRS总患病率为10.9%，美国患病率约11.9%［1-2］。我国CRS 总患病率约8%，近1.07 亿人患有CRS［3］，目前已成为我国一个重要的社会卫生问题。CRS 临床表现为鼻塞、流涕、头痛或嗅觉减退，且反复发作，严重影响患者的生活质量［4］。目前已有许多关于CRS 病因的研究，但其发病机制尚不明确，仍处于探索阶段。治疗包括以足量抗生素及糖皮质激素为主的保守治疗，以及功能性鼻内镜手术，但存在总体治疗疗效不佳、难以抉择手术时机、术后复发率高等几大难题。中医药潜在的疗效及作用机制研究可能成为寻求CRS新靶点及新治疗方式的突破点。

长链非编码RNA（lncRNA）是一类长于200 核苷酸不编码蛋白质的RNA 分子，广泛涉及各种疾病的发生发展。近年来发现lncRNA 在炎症疾病中特异性表达，通过多种机制调控炎症信号通路或炎症因子，发挥促炎或抗炎作用［5］。研究［6-7］表明，lncRNA 在鼻腔炎症疾病中扮演着重要角色，但具体机制尚不明确。lncRNA小核仁RNA 宿主基因16（lncRNA SNHG16）被发现在CRS 中可促进黏蛋白5AC（MUC5AC）的表达增多［8］。表皮生长因子受体（EGFR）作为经典的炎症信号通路，对MUC5AC 的分泌起调节作用［9］，但与lncRNA SNHG16的关系尚未见报道。辛前甘桔汤是海派名医张赞臣治疗CRS “通窍排脓法”的经验方，能明显改善患者鼻塞、流涕等临床症状［10］。本研究拟通过观察辛前甘桔汤对CRS 小鼠lncRNA SNHG16/EGFR 信号通路及MUC5AC的影响，探索辛前甘桔汤改善CRS 黏液高分泌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 C57BL/6小鼠36只，雄性，体质量20～22 g，SPF 级，购自上海斯莱克实验动物公司，饲养于上海中医药大学实验动物中心。动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005。动物使用许可证号：SCXK（沪）2020-0009。动物饲养环境保持昼夜节律交替，自由饮水及进食，温度为20～24 ℃，湿度为50%～70%。本实验方案经上海中医药大学实验动物伦理委员会批准（伦理批准号：PZSHUTCM211227022）。

1.1.2 药物及试剂 辛前甘桔汤方组成：辛夷6 g，防风6 g，前胡9 g，天花粉9 g，薏苡仁12 g，桔梗4.5 g，生甘草3 g。药材均购自上海中医药大学附属曙光医院中药房。所有中药材水煎2次，合并浓缩成含生药1 g/mL的药液，离心取上清后滤过除菌，冰箱4 ℃保存备用。

羧甲司坦口服溶液，白云山汤阴东泰药业有限责任公司（批号：12200218513）。金黄色葡萄球菌ATCC25923，由上海市疾病预防控制中心提供。

总RNA 抽提试剂（TRIzol），美国Invitrogen 公司（批号：15596018）；三氯甲烷，上海试剂一厂（批号：2006-06-08）；异丙醇，国药集团药业股份有限公司（批号：AR80109218）；乙醇，国药集团药业股份有限公司（批号：AR10009218）；焦碳酸二乙酯（DEPC）水，上海司鼎生物科技有限公司（批号：SD01005）；反转录试剂盒（RT reagent Kit）、荧光定量qPCR 试剂盒（TB Green qPCR），日本Takara 株式会社（批号：RR047A、RR420A）；琼脂糖（agarose），上海司鼎生物科技有限公司（批号：SD0241）；小鼠白介素-6（IL-6）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒、小鼠基质金属蛋白酶-9（MMP-9）ELISA 试剂盒、小鼠白介素-8（IL-8）ELISA 试剂盒，上海司鼎生物科技有限公司（批号：SDM0008、SDM0087、SDM0140）；兔抗MUC5AC 多克隆抗体（Rabbit Anti-MUC5AC），北京博奥森生物技术有限公司（批号：BS-7166R）；表皮生长因子受体（EGFR）多克隆抗体，武汉亚科因生物技术有限公司（批号：ABP51236）。

1.1.3 主要仪器 酶标检测仪，瑞士Tecan 公司（型号：F50）；台式冷冻高速离心机，德国Eppendorf 公司（型号：5810R）；漩涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司（型号：VORTEX-5）；高通量组织研磨器，上海净信科技有限公司（型号：Tissuelyser-48）；分光光度计，美国Thermo Fisher Scientific 公司（型号：NanoDrop 2000）；PCR 仪，美国Applied Biosystems 公司（型号：Veriti 96-Well Thermal Cycler）；qPCR 仪，瑞士Roche 公司（型号：LightCycler®480Ⅱ）；凝胶成像系统，上海天能科技有限公司（型号：GIS2009）。

1.2 分组与造模 将36 只小鼠随机分为6 组，分别为正常组、模型组、羧甲司坦组和辛前甘桔汤低、中、高剂量组，每组6 只。除正常组外均行CRS 模型造模［11］，小鼠腹腔注射地西泮5 mg/kg 麻醉后，将膨胀海绵片置入小鼠左侧鼻腔，金黄色葡萄球菌标准菌株悬浊液左侧鼻腔内灌注。饲养6 周后苏木精-伊红（HE）染色观察小鼠鼻黏膜组织慢性炎症表现，见大量炎症细胞浸润、杯状细胞增生、纤毛脱落即表示CRS 小鼠模型建立成功。

1.3 干预方法 造模第43 天起灌胃给予羧甲司坦口服液（0.3 mL·kg-1·d-1）、辛前甘桔汤水煎液（0.3、0.6、1.2 g·kg-1·d-1，分别相当于成人用量的0.5、1、2 倍），正常组与模型组小鼠灌胃质量分数为0.9%的氯化钠溶液（0.6 g·kg-1·d-1），连续干预14 d 后，收集小鼠鼻黏膜组织，进行液氮封存待用。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 鼻黏膜组织病理学改变 取适量鼻黏膜组织，通过乙醇梯度脱水、透明、浸蜡等操作后，石蜡包埋，制作切片（厚度约5 μm）。①常规脱蜡、脱水、二甲苯透明，封固后进行苏木精-伊红（HE）染色；②以3%醋酸溶液浸染3 min，阿尔新蓝浸染30 min，复以3%醋酸溶液浸染3 min，水洗，0.5%过碘酸溶液氧化10 min，入希夫液中浸染20 min，封固后进行阿尔新蓝-过碘酸雪夫（AB-PAS）染色。分别在光学显微镜下观察各组小鼠鼻黏膜组织的病理学改变。

1.4.2 鼻黏膜组织中EGFR、MUC5AC 的表达 采用免疫组织化学法检测鼻黏膜组织中EGFR、MUC5AC 的表达情况。取适量鼻黏膜组织，常规石蜡包埋切片，脱蜡复水，磷酸缓冲盐溶液（PBS）缓冲液清洗，使用一抗、二抗进行抗原修复，二氨基联苯胺（DAB）显色常规脱水、透明、封片后镜下观察。400 倍光镜下随机观察6 个视野，采用ImagePro Plus6.0（IPP 6.0）专业图像采集及分析系统计算图像积分光密度（IOD）值。

1.4.3 鼻黏膜组织中IL-6、IL-8、MMP-9 的水平 采用

ELISA 检测鼻黏膜组织IL-6、IL-8、MMP-9 的水平。取各组小鼠鼻黏膜组织适量，加入放射免疫沉淀（RIPA）裂解液后充分研磨组织，研磨后的组织悬液放置在4 ℃离心机中离心20 min（13 000 r/min），取上层澄清液。按照ELISA 试剂盒说明书测定鼻黏膜组织上层澄清液IL-6、IL-8、MMP-9含量。

1.4.4 鼻黏膜组织中lncRNA SNHG16、EGFR、MUC5ACmRNA 的表达 取各组小鼠鼻黏膜置于研钵中，加入TRIzol 裂解液提取总RNA，再逆转录合成cDNA，以β-肌动蛋白基因（β-actin）为内参进行荧光定量PCR 扩增以检测各组小鼠鼻黏膜组织中lncRNA SNHG16、EGFR、MUC5ACmRNA 的表达水平。扩增引物序列见表1。反应条件：95 ℃预变性15 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，40 个循环。利用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

表1 引物序列

1.5 统计学方法 所有数据采用SPSS 19.0 统计学软件进行分析处理。计量资料均以表示，多组数据间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对鼻黏膜组织病理学的影响 HE和AB-PAS染色结果显示，正常组小鼠鼻黏膜上皮完整，纤毛完整，杯状细胞少见。模型组鼻黏膜上皮结构紊乱，纤毛脱落及粘连明显，杯状细胞增生，伴有大量炎症细胞浸润。与模型组比较，辛前甘桔汤不同剂量组的小鼠鼻黏膜炎症程度明显减轻，纤毛少量粘连，杯状细胞增生较模型组减轻；羧甲司坦组鼻黏膜上皮纤毛局部粘连，杯状细胞增生减轻。见图1。

2.2 对鼻黏膜组织中EGFR、MUC5AC 表达的影响

免疫组织化学结果显示，与正常组比较，模型组EGFR 及MUC5AC表达升高。与模型组比较，辛前甘桔汤低、中、高剂量组鼻黏膜组织EGFR、MUC5AC 的表达降低，其中辛前甘桔汤高剂量组EGFR 及MUC5AC的表达最低。见图2、图3。与正常组比较，模型组IOD 值升高（P＜0.05）；与模型组比较，辛前甘桔汤各剂量组IOD值降低（P＜0.05），辛前甘桔汤高剂量组IOD值最低。辛前甘桔汤各剂量组间EGFR 的IOD 值差异无统计学意义（P＞0.05），辛前甘桔汤高剂量组较辛前甘桔汤低剂量组MUC5AC的IOD值降低（P＜0.05）；与羧甲司坦组比较，辛前甘桔汤高剂量组MUC5AC的IOD值降低（P＜0.05）。见表2。

图2 各组鼻黏膜组织表皮生长因子受体（EGFR）表达情况（免疫组织化学染色，×400）

图3 各组鼻黏膜组织黏蛋白5AC（MUC5AC）表达情况（免疫组织化学染色，×400）

表2 各组鼻黏膜组织EGFR、MUC5AC光密度比较（n=6，±s）

表2 各组鼻黏膜组织EGFR、MUC5AC光密度比较（n=6，±s）

注：EGFR为表皮生长因子受体，MUC5AC为黏蛋白5AC。与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与羧甲司坦组比较，△P＜0.05；与辛前甘桔汤高剂量组比较，▲P＜0.05。

MUC5AC 24.66±7.69 98.44±23.09*69.32±12.96*#▲48.22±16.52#29.09±3.81#△78.22±19.39*组别正常组模型组辛前甘桔汤低剂量组辛前甘桔汤中剂量组辛前甘桔汤高剂量组羧甲司坦组EGFR 14.65±3.55 164.08±33.06*94.21±15.31*#75.26±20.29*#60.99±11.79*#76.71±10.21*#

2.3 对鼻黏膜IL-6、IL-8、MMP-9 表达的影响 与正常组比较，模型组IL-6、IL-8、MMP-9含量明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，辛前甘桔汤低、中、高各剂量组IL-6 含量降低（P＜0.05），辛前甘桔汤中、高剂量组MMP-9、IL-8含量降低（P＜0.05）；羧甲司坦组IL-6含量降低（P＜0.05），IL-8、MMP-9含量差异无统计学意义（P＞0.05）。与羧甲司坦组比较，辛前甘桔汤低剂量组IL-6 含量差异有统计意义（P＜0.05）。辛前甘桔汤各剂量组间MMP-9、IL-8含量差异无统计学意义（P＞0.05），辛前甘桔汤高剂量组IL-6 含量较辛前甘桔汤低剂量组降低（P＜0.05）。见表3。

表3 各组鼻黏膜组织MMP-9、IL-8、IL-6含量比较（n=6，±s，ng·L-1）

表3 各组鼻黏膜组织MMP-9、IL-8、IL-6含量比较（n=6，±s，ng·L-1）

注：MMP-9为基质金属蛋白酶-9，IL-8为白介素-8，IL-6为白介素-6。与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与羧甲司坦组比较，△P＜0.05；与辛前甘桔汤高剂量组比较，▲P＜0.05。

IL-6 60.72±8.45 160.83±16.17*94.95±5.24*#△▲89.94±4.84*#71.17±6.42#78.94±16.69*#组别正常组模型组辛前甘桔汤低剂量组辛前甘桔汤中剂量组辛前甘桔汤高剂量组羧甲司坦组MMP-9 653.47±149.80 2 677.52±377.42*1 811.38±250.81*1 629.74±321.43*#1 542.91±238.82#1 729.06±284.08*IL-8 310.85±42.54 434.91±56.39*387.28±15.15*375.50±42.23*#347.48±27.72#371.28±69.47*

2.4 对鼻黏膜lncRNA SNHG16、EGFR、MUC5AC mRNA表达的影响 与正常组比较，模型组lncRNA SNHG16、EGFR、MUC5ACmRNA 表达明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，辛前甘桔汤低、中、高各剂量组及羧甲司坦组lncRNA SNHG16、EGFR、MUC5ACmRNA 表达均显著降低（P＜0.05）。与羧甲司坦组比较，辛前甘桔汤低剂量组lncRNA SNHG16、EGFR、MUC5ACmRNA 表达差异有统计学意义（P＜0.05），辛前甘桔汤中剂量组MUC5ACmRNA表达差异有统计学意义（P＜0.05），辛前甘桔汤高剂量组lncRNA SNHG16、EGFRmRNA 表达明显降低（P＜0.05）。辛前甘桔汤各剂量组之间lncRNA SNHG16mRNA 表达差异无统计学意义（P＞0.05）；辛前甘桔汤各剂量组之间EGFR、MUC5ACmRNA 表达差异均有统计学意义（P＜0.05），其表达水平随剂量的升高而降低。见表4。

表4 各组鼻黏膜组织lncRNA SNHG16、EGFR、MUC5AC mRNA表达情况比较（n=6，±s，2-ΔΔCt）

表4 各组鼻黏膜组织lncRNA SNHG16、EGFR、MUC5AC mRNA表达情况比较（n=6，±s，2-ΔΔCt）

注：lncRNA SNHG16 为长链非编码RNA 小核仁RNA 宿主基因16，EGFR 为表皮生长因子受体基因，MUC5AC 为黏蛋白5AC 基因。与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与羧甲司坦组比较，△P＜0.05；与辛前甘桔汤高剂量组比较，▲P＜0.05；与辛前甘桔汤中剂量组比较，□P＜0.05。

MUC5AC 组别lncRNA SNHG16 EGFR 3.96±0.22 29.75±3.82*24.27±0.50*#△▲□16.05±1.79*#△▲4.20±1.34#5.98±1.02*#正常组模型组辛前甘桔汤低剂量组辛前甘桔汤中剂量组辛前甘桔汤高剂量组羧甲司坦组0.99±0.06 1.93±0.14*1.50±0.43*#△1.38±0.43*#1.27±0.21*#△1.35±0.14*#1.98±0.08 4.94±0.42*3.29±0.54*#△▲□2.50±1.99*#▲1.99±0.47#△2.56±0.25*#

3 讨论

CRS 可归属中医学“鼻渊”范畴。《素问·气厥论》载：“胆移热于脑，则辛頞鼻渊。鼻渊者，浊涕下不止也。”鼻渊之病因病机多为“胆移热于脑”，症见鼻流浊涕，量多不止。辛前甘桔汤是已故著名中医耳鼻喉科专家张赞臣先生在古方的基础上结合多年临床经验总结的“通窍排脓法”自拟经验方，可显著改善患者鼻塞、流涕症状［10］。全方由辛夷、防风、前胡、天花粉、薏苡仁、桔梗及生甘草组成。辛夷为君药，入肺经，散风寒、通鼻窍。辛夷挥发油成分丰富，可下调炎症损伤中白介素-1β（IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及超氧化物歧化酶（SOD）表达，具有抗炎、抗过敏、抗氧化等作用［12］。辛夷配以防风可祛风解表解痉，加强祛风之力。防风中色原酮、香豆素和1-酰基甘油等有效成分还可发挥镇静镇痛作用［13］。前胡与桔梗辛开苦降，降气化痰。前胡有效成分北美芹素可通过阻断核因子-κB/丝裂原活化蛋白激酶（NF-κB/MAPK）信号转导，并抑制NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）启动和激活，从而预防炎症［14］。桔梗可通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路消除炎症［15］。天花粉与薏苡仁共奏消肿排脓之功。现代药理研究［16-17］证明，天花粉可明显抑制巨噬细胞中一氧化氮的生成，还可分解黏蛋白稀释痰液。薏苡仁还可发挥抗炎镇痛效果［18］。甘草调和诸药，性平温和，从而治疗CRS。

lncRNA 在人类疾病发生发展中发挥重要的生物学功能，如染色质修饰、转录、转录后调节和核运输［19-20］。lncRNA SNHG16位于染色体17q25.1 处，首次在侵袭性神经母细胞瘤中发现［21］，随后发现与多种癌症相关，且与预后关系密切［22-23］。近年来研究表明，lncRNA SNHG16在炎症疾病中亦表达异常。lncRNA SNHG16可促进脂多糖诱导的炎症反应［24］，还可通过参与PI3K/Akt 信号通路及转化生长因子-β（TGF-β）信号转导介导炎症反应［25-26］。在一项非小细胞肺癌的研究［27］中发现MUC5AC 受lncRNA SNHG16的调控，在促进细胞增殖、迁移方面发挥积极作用。袁薇［8］通过体外原代鼻黏膜上皮细胞培养，证实lncRNA SNHG16可促进MUC5AC 的表达增多。MUC5AC 是鼻腔鼻窦黏膜分泌的主要黏蛋白之一，是黏液的主要组成成分。CRS中高表达黏蛋白MUC5AC 和黏蛋白5B（MUC5B），从而引起黏液高分泌，是导致患者鼻腔黏液积蓄及流涕的主要病理机制［28］。

EGFR 在鼻黏膜杯状细胞、上皮细胞和基底细胞中均有表达［29］。EGFR 与表皮细胞生长因子（EGF）、转化生长因子-α（TGF-α）等配体结合后，与自身或家族成员形成二聚体导致磷酸化，激活下游MAPK 信号通路［30］、PI3K/Akt 信号通路［31］、酪氨酸蛋白激酶/信号转导因子和转录激活因子3（JAK/STAT3）信号通路［32］，激活NFκB 转录因子或者SP1 转录因子，促进IL-8、IL-6 等炎症因子释放及MUC5AC、MUC5B 的表达［33］，激活MMP-9的活性并增加其表达［34］。MMP-9是组织重塑的关键因素，而组织重塑是鼻息肉形成的主要原因［35-36］。

本研究结果显示，模型组小鼠鼻黏膜组织炎症通路相关因子IL-8、IL-6、MMP-9 及EGFR 显著升高。辛前甘桔汤干预后，各项指标明显改善，且呈现浓度依赖，其中以高剂量组改善最显著，提示辛前甘桔汤可明显改善鼻黏膜炎症反应。模型组鼻黏膜杯状细胞增生明显，MUC5AC表达升高，而辛前甘桔汤各剂量组均可有效减轻黏液高分泌。lncRNA SNHG16在模型组中高表达，辛前甘桔汤各剂量组可抑制lncRNA SNHG16表达，提示辛前甘桔汤可能通过抑制lncRNA SNHG16表达、影响EGFR 炎症通路及黏蛋白MUC5AC 表达而对CRS发挥治疗作用。

综上，辛前甘桔汤能降低lncRNA SNHG16、EGFR、MUC5ACmRNA 表达，降低EGFR、MUC5AC 蛋白表达，减少IL-6、IL-8、MMP-9 表达，进而改善鼻黏膜病理改变。