灵芝诱导子对南方红豆杉悬浮培养细胞产紫杉醇的影响

邱 涵，孟丽媛，杨婉婷，凌树玉，任凯利，魏赛金

（1.江西农业大学应用微生物研究所，江西 南昌 330045；2.江西农业大学生物科学与工程学院，江西 南昌 330045）

南方红豆杉（Taxus wallichianavar.mairei）在江西也称为红叶水杉，是国家一级重点保护野生植物[1]。紫杉醇是一种从短叶杉树皮中提取的二萜类生物碱，被认为是世界上最有效的广谱抗癌药物之一[2]。若干年来，红豆杉一直是紫杉醇的天然来源，但是红豆杉产紫杉醇的量极少，供应短缺限制了紫杉醇的临床应用[3]。目前，已采用多种方法解决紫杉醇的供应问题[4]，其中，利用植物细胞工程技术提高紫杉醇产量是保护稀缺红豆杉资源和解决紫杉醇药源紧缺的有效途径之一[5]，但其紫杉醇产量仍然比较低。

真菌能够合成一种被植物细胞表面特定受体识别的保守分子（MAMPs），引发植物细胞内的防御反应，促进次生代谢产物的积累[6]。真菌诱导子能有效诱导植物悬浮细胞体系中次生代谢产物的积累，其诱导机制包括诱导子的识别、信号转导、基因表达以及关键酶的激活等[7]。因此，真菌诱导子添加到南方红豆杉细胞悬浮培养液中，可以提高紫杉醇的产量。李家儒等[8]在红豆杉细胞悬浮培养到20 d 时，加入桔青霉（Penicillum citrinum）诱导子，使细胞紫杉醇的含量达到199.1 μg/g。李永成等[9]在东北红豆杉悬浮细胞培养时，利用4%（体积比）的美丽镰刀菌（Fusarium mairei）培养液及4%（质量与体积比）的胞外多糖分别处理细胞，2种处理均诱导了东北红豆杉细胞的防御反应，使紫杉醇的合成分别提高了2.5、1.5 倍。而关于药用真菌诱导子提高紫杉醇含量的研究尚未见报道，鉴于此，拟研究灵芝（Ganoderma lucidum）诱导子对南方红豆杉悬浮培养细胞生长的影响，为南方红豆杉细胞高产紫杉醇提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 材料 南方红豆杉愈伤组织：以南方红豆杉约2 年生嫩枝条为材料组培获得，继代培养至5 代以上[10]。灵芝为多孔菌科真菌赤芝，保存于江西农业大学应用微生物研究所。

1.1.2 培养基 在B5培养基（购自杭州百思生物技术有限公司）内加0.4 mg/L 2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、0.3 mg/L NAA（1-萘乙酸）、1.2 mg/L 6-KT（6-糠氨基嘌呤）和30 g/L 蔗糖、PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基，活化灵芝菌）、PDB（马铃薯葡萄糖水培养基，培养灵芝菌），经115 ℃灭菌30 min待用。

1.1.3 试剂 紫杉醇标准品（色谱纯）购自北京索莱宝科技有限公司；甲醇（高效液相级）、乙腈（色谱纯）、异丙醇（色谱纯）、2，4-D、NAA、6-KT 均购自中国医药集团有限公司。

1.2 仪器和设备

主要仪器和设备包括Agilent1260 高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）、SHP-250 智能生化培养箱（上海三发科学仪器有限公司）、SPH-3112 双层摇床机（上海世平实验仪器设备有限公司）、GENESYS50紫外可见分光光度计（赛默飞世尔科技公司）、SU8100型生物扫描电子显微镜（日立高新技术有限公司）等。

1.3 试验方法

1.3.1 红豆杉悬浮细胞培养 选取颗粒疏松、黄白色、生长良好的愈伤组织，按照0.09 g/mL 的接种量接种到30 mL 上述待用B5 培养基中，（24±1）℃、120 r/min悬浮暗培养。

1.3.2 灵芝诱导子的制备 将活化后的灵芝挖块接种于PDB 培养基，于28 ℃、120 r/min 培养7 d，抽滤洗涤，收集菌丝体。以酸解法[11]制备灵芝诱导子。诱导子的质量浓度以总糖含量表示，采用蒽酮-硫酸比色法[12]测定。

1.3.3 灵芝诱导子的添加（1）灵芝诱导子最佳添加质量浓度试验：细胞悬浮培养至第8天，分别添加质量浓度为0、10、100、500、1 000 μg/mL 的诱导子，继续培养至第21 天，测定细胞生长指数、紫杉醇总产量。

（2）灵芝诱导子最佳添加时间试验：分别在第0、4、8、12、16 天添加100 μg/mL 诱导子，培养至第21天，测定细胞生长指数、紫杉醇总产量。

（3）灵芝诱导子最佳持续作用时间试验：在红豆杉细胞悬浮培养的第8 天加入100 μg/mL 诱导子（LZ），以加入等量蒸馏水为对照（CK），之后的第0、2、4、6、8天，测定细胞生长指数、紫杉醇总产量。

（4）灵芝诱导子对南方红豆杉悬浮细胞影响试验：在红豆杉细胞悬浮培养第8 天加入100 μg/mL灵芝诱导子，扫描电子显微镜观察细胞形态，测定细胞生长第8、10、12、16、21、24 天的干质量和鲜质量、紫杉醇总产量、细胞活力、总酚含量、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、多酚氧化酶（PPO）活性。

1.4 指标测定

1.4.1 细胞生长量、紫杉醇总产量的测定 悬浮细胞生长指数参照参考文献[13]测定；采用李永成等[14]的方法提取胞外紫杉醇，采用赵继鹏等[15]的方法提取胞内紫杉醇，采用高效液相测定法[13]测定紫杉醇产量。紫杉醇总产量是细胞外和细胞内紫杉醇产量之和。

1.4.2 细胞形态观察 取灵芝诱导子处理后悬浮培养至第21 天的红豆杉细胞，参照参考文献[16]使用扫描电子显微镜观察其表面形态。

1.4.3 PAL 活性、细胞活力、PPO 活性、总酚含量测定 加入诱导子之后，悬浮细胞生长第8、10、12、16、21、24 天的PAL 活性测定参照参考文献[17]；采用TTC 还原法在485 nm 紫外分光光度计下测定悬浮细胞活力；PPO 活性测定参照参考文献[18]；胞内总酚含量采用张长平等[17]的方法测定，用水杨酸作为标准品来衡量总酚的质量浓度。

1.5 数据处理

用Excel 2016 记录数据，数据取3 个平行试验的平均值，误差用标准差表示；用SPSS 22.0 进行单因素ANOVA检验；用Origin 2021制图。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度和添加时间灵芝诱导子对南方红豆杉细胞生长及紫杉醇合成的影响

由表1 可知，在南方红豆杉细胞悬浮培养至第8 天、添加灵芝诱导子质量浓度低于100 μg/mL 时，细胞生长指数和紫杉醇总产量随着诱导子质量浓度的增加而逐渐增加，当诱导子质量浓度为100 μg/mL时，细胞生长指数为36.39%，紫杉醇总产量为1.39 mg/L，显著高于其他组（P＜0.05）。而当添加的诱导子质量浓度高于100 μg/mL 时，随诱导子质量浓度升高细胞生长指数和紫杉醇总产量开始降低，不利于细胞生长。综上，在培养基中加入100 μg/mL 的诱导子，有利于细胞生长及紫杉醇的合成，因此认为该质量浓度为诱导子添加的最佳质量浓度。

表1 灵芝诱导子不同质量浓度和添加时间下南方红豆杉细胞生长指数及紫杉醇的产量Tab.1 Cell growth index and total paclitaxel production of Taxus wallichiana var.mairei under different concentration and addition time of Ganoderma lucidum elicitor

灵芝诱导子最佳添加时间试验结果（表1）表明，当诱导子在细胞生长的第8天加入、悬浮培养至第21 天时，细胞生长指数为28.92%，紫杉醇总产量为1.49 mg/L，两者均明显高于其他添加时间时细胞的生长指数及紫杉醇总产量。因此，诱导子最佳添加时间为细胞悬浮培养第8天。

2.2 诱导子持续作用时间对南方红豆杉细胞生长及紫杉醇合成的影响

由表2 可知，在细胞生长的第8 天加入灵芝诱导子，持续培养6 d 时，CK 细胞生长指数为34.37%，紫杉醇总产量为1.90 mg/L；灵芝诱导子处理后，细胞生长指数为58.73%，紫杉醇总产量为2.75 mg/L。灵芝诱导子处理后细胞生长指数较CK 提高了70.88%，紫杉醇总产量提高了44.74%。灵芝诱导子处理后6 d 细胞生长指数、紫杉醇总产量均明显高于其他持续作用时间的细胞生长指数、紫杉醇总产量（P＜0.05），说明培养时间过短和过长均不利于细胞生长和紫杉醇合成。

表2 灵芝诱导子不同持续作用时间下南方红豆杉细胞生长指数及紫杉醇总产量Tab.2 Cell growth index and total paclitaxel production of Taxus wallichiana var.mairei under different duration of Ganoderma lucidum elicitor treatment

2.3 最佳条件下诱导子对南方红豆杉细胞悬浮培养的影响

2.3.1 南方红豆杉细胞鲜质量、干质量、紫杉醇总产量的变化 灵芝诱导子处理后南方红豆杉细胞鲜质量、干质量、紫杉醇总产量明显高于CK，培养21 d 时均达到最大值，灵芝诱导子处理后细胞鲜质量为5.71 g，达CK的173.56%；细胞干质量为1.57 g，达CK 的221.13%；紫杉醇总产量为10.68 mg/L，达CK的569.69%（图1）。

图1 灵芝诱导子处理后悬浮培养细胞鲜质量、干质量、紫杉醇总产量的变化Fig.1 Changes of fresh weight，dry weight and total paclitaxel production of suspension culture cells after Ganoderma lucidum elicitor treatment

2.3.2 灵芝诱导子对南方红豆杉悬浮细胞形态的影响 扫描电镜观察结果（图2）表明，灵芝诱导子处理后，与CK 比较，南方红豆杉细胞膜表面结构发生明显变化，小分子物质增多，细胞膜变得更加光滑，黏膜状物质大量增加，细胞表面物质连接更加紧密，球状物质大量增加且体积更大。

图2 灵芝诱导子处理后红豆杉悬浮细胞形态变化（×15 000）Fig.2 Morphological changes of suspension cells of Taxus wallichiana after Ganoderma lucidum elicitor treatment（×15 000）

2.3.3 灵芝诱导子对南方红豆杉悬浮细胞PAL 活性和细胞活力的影响 苯丙烷代谢途径是植物防御反应和次生代谢产物形成的重要生化途径，而PAL 是该途径中的第一个重要酶[19]，在紫杉醇合成中其支链的形成也与该途径有重要关系。由图3可知，细胞悬浮培养8～12 d 时，灵芝诱导子处理后的红豆杉细胞PAL 活性与CK 相比明显上升，并在12 d 时达到峰值，为49.43 U/g；16～24 d 时诱导子处理后的酶活性开始降低，但仍高于CK。诱导子处理后的南方红豆杉细胞活力与CK 相比明显降低，培养16 d 时CK 细胞活力为0.84，灵芝诱导子处理后的细胞活力为0.41。培养8～16 d 时，灵芝诱导子处理后的细胞活力下降趋势较对照明显。

图3 灵芝诱导子处理后悬浮培养细胞PAL活性和细胞活力变化Fig.3 Changes of PAL enzyme activity and cell vitality after Ganoderma lucidum elicitor treatment

2.3.4 灵芝诱导子对南方红豆杉悬浮培养细胞PPO活性和总酚含量的影响 PPO可以催化氧化酚类物质，酚类物质的积累又与褐化有直接关系，细胞褐化会使细胞膜结构发生变化或遭破坏，细胞分裂和生长受到抑制[20]。由图4 可知，灵芝诱导子处理后的PPO 活性与CK 相比明显降低。第8 天没有加入诱导子时，细胞内总酚质量浓度为25.79 mg/L。在加入诱导子后细胞总酚质量浓度与CK 相比明显上升，16 d 时灵芝诱导子处理的细胞总酚质量浓度为CK的297.72%。诱导后期，培养21～24 d时，不同处理细胞总酚质量浓度均下降，但是诱导子处理后的总酚质量浓度仍高于CK。

3 结论与讨论

通过南方红豆杉细胞悬浮培养生产紫杉醇是解决紫杉醇短缺的一个途径[21]。本研究结果表明，灵芝制备的诱导子对南方红豆杉细胞生长和紫杉醇合成有明显促进作用。培养21 d 时，灵芝诱导子处理红豆杉细胞产紫杉醇总产量为10.68 mg/L，是CK 的569.69%，说明灵芝诱导子的添加促进了紫杉醇的合成，与李永成等[9]的研究结果比较，本研究中的灵芝诱导子对紫杉醇合成的促进效果更佳。植物悬浮细胞的培养是生产次级代谢物的常用手段之一，而外源性诱导剂可以显著增加植物细胞中相关次级代谢物的积累[7]。真菌粗提物中的多糖物质可能对红豆杉细胞具有诱导活性[22]。研究表明，在红豆杉细胞对数生长后期诱导可获得较高的紫杉醇积累[14，23]。本研究中，在细胞悬浮培养至第8 天时，加入100 μg/mL 灵芝诱导子，改变了红豆杉细胞的培养环境，细胞膜表面发生明显变化，细胞表面小分子物质增多，细胞膜变得更加光滑。这可能是灵芝诱导子刺激了红豆杉悬浮细胞和外界环境的快速应答反应，植物防御反应被启动，调控了红豆杉细胞的次级代谢途径[24]，从而促进了紫杉醇产量的增加。

PAL 是苯丙氨酸代谢途径中的一个关键酶，也是植物防御反应中的一个标志性酶。它参与植物信号分子水杨酸、苯甲酸、苯甲异丝氨酸（紫杉醇侧链）、酚和一系列与植物防御反应相关化合物的合成[9]。灵芝诱导子处理后的红豆杉细胞PAL 的活性显著提高，细胞活力下降更迅速。灵芝诱导子添加后，在诱导前期促进了细胞的代谢，加快了细胞的生长凋亡，细胞活力明显降低[25]；在诱导后期促使细胞生长保持稳定、PAL 活性恢复正常，细胞活力保持稳定。在细胞悬浮培养第8 天添加100 μg/mL 诱导子后，可能立刻诱导了相关基因的表达，并调控基因在短时间内完成转录和复制[26]。PAL的激活及酚的积累意味着植物防御反应被启动[27]。灵芝诱导子加入前期PPO 活性受到抑制，有利于细胞内酚的积累，可能是因为细胞应答真菌诱导剂的入侵，降低了PPO 活性，增加了酚类化合物的合成以减少损害[28]。随着酚含量的增加，PPO 活性逐步上升，分解了多余的酚类，避免酚类过多对细胞自身的伤害[17]。保持适当浓度的酚类化合物有利于增加紫杉醇的产量[29]。本研究中，灵芝制备的真菌诱导子能有效激活南方红豆杉细胞PAL 活性，提高细胞总酚含量，降低细胞活力和PPO 活性，说明灵芝诱导子可能通过介导植物的防御反应来促进紫杉醇合成，灵芝诱导子的诱导前期可以降低红豆杉细胞PPO 活性，从而提高愈伤组织的生长量，这与MARCHEV等[30]的研究结果一致。但灵芝诱导子的添加是否增强了紫杉醇合成相关基因的表达和紫杉醇合成过程中的关键酶活性，仍有待进一步研究。