基于网络药理学与分子对接探讨四妙丸“异病同治”强直性脊柱炎和高尿酸血症的作用机制

陈聪聪,周全

1.河南中医药大学,河南 郑州 450046; 2.河南中医药大学第一附属医院,河南 郑州 450001

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种免疫介导的慢性炎症性脊柱关节疾病,主要侵犯骶髂关节、中轴关节从而引起慢性疼痛、僵硬、骨质破坏,甚至出现强直畸形,丧失生理功能。该病目前没有明确的致病机制及根治方法,临床以缓解症状,恢复身体功能,防止关节损伤,提高生活质量为主要治疗目标[1-2]。高尿酸血症(hyperuricemia,HUA)是嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄减少引起血尿酸升高的一种代谢相关疾病,是诸多疾病如心血管、肾脏疾病的危险因素[3]。近年来,随着人们生活结构的改变,HUA患病率越来越高而且趋于年轻化,据报道,我国HUA患病率约为13.3%[4]。

中医药在防治疾病方面有独特的疗效,也有“异病同治”的优势,即不同的疾病,病机相同,则可以采用相同的方法进行治疗,其思想核心在于“辨病”与“辨证”结合[5]。中医认为,AS属于“痹证” “大偻”范畴,《素问·痹论》云:“痹者,风寒湿三气杂至,合而为痹。”《素问·脉要精微论》云:“腰者肾之府,转摇不能,肾将惫矣。”综合现代医家论述可知,AS发病以肾虚为主,外邪趁虚而入,日久郁而化热,血行不畅,痰瘀内生,痹阻筋骨经脉所致[6-7]。HUA属于“膏浊病” “浊瘀痹”范畴,孙维峰教授用“脾、肾、痰、瘀” 4个字高度概括了HUA的病机,认为治疗时以活血化瘀、利湿化痰为主,佐以健脾益肾[8]。二者发病基础均有肾虚,与湿、热、痰、瘀诸邪有关,可为中医“异病同治”两种疾病提供基础。

四妙丸出自清代张秉承所著的《成方便读》,由苍术、黄柏、牛膝和薏苡仁4味药物组成,其中黄柏苦寒,善清热燥湿,除下焦湿热,为君药;苍术苦燥温散、燥湿健脾,薏苡仁渗湿健脾除痹,两药合用,助君药以除生湿之源;牛膝善补肝肾、强筋骨、利关节,通利血脉,又能引药下行直达下焦,全方共奏清热利湿、舒筋壮骨之功,可以治疗湿热下注所致的多种疾病,临床用于AS和HUA疗效显著。研究表明,四妙丸能显著改善湿热型AS患者的临床症状,降低炎症水平,提高临床疗效[9]。陈杰伟等[10]发现四妙丸可以降低HUA大鼠血清尿酸水平。

网络药理学在系统生物学理论指导下,运用药理学、生物信息学、网络科学等学科内容和技术,从分子水平层面系统整体地揭示中药成分对疾病的作用关系,为中医药现代化研究提供了有效方法[11]。本文基于网络药理学对四妙丸治疗AS和HUA的关键成分、核心靶点、生物过程和信号通路进行预测,并利用分子对接技术评估生物大分子和小分子配体之间结合构象的稳定性,对预测结果进行验证[12],从“异病同治”的角度阐述四妙丸发挥作用的相关机制,以期为后续研究提供新的思路和参考。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分及其相关作用靶点搜集利用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)分别检索四妙丸所含药物苍术、黄柏、牛膝、薏苡仁的活性成分及其蛋白作用靶点,以药代动力学参数中口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且类药性指数(drug-likeness,DL)≥0.18为条件进行筛选,并通过Uniprot数据库(http://www.uniprot.org)将获取的相关靶点名称规范为基因靶标。

1.2 疾病靶点检索以“ankylosing spondylitis”“hyperuricemia”为关键词,设置物种为“Homo Sapiens”,在在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://www.omim.org/)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)和DrugBank数据库(https://go.drugbank.com/)中检索AS与HUA的疾病靶点。将3个数据库获得的结果进行整理去重,获得AS与HUA最终疾病靶点。

1.3 “药物-有效成分-潜在靶点-疾病”网络构建将获得的药物相关靶点与疾病靶点输入在线工具Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)绘制韦恩图,得到交集靶点,即为四妙丸异病同治AS与HUA的潜在靶点。将潜在靶点及其对应的活性成分、药物、疾病名称导入Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-有效成分-潜在靶点-疾病”网络,并利用Network Analyzer工具计算节点的度值(Degree),筛选出四妙丸中的关键成分,Degree值越高,该活性成分发挥作用越大。

1.4 蛋白质互作网络(protein-protein interaction networks,PPI)构建与核心靶点筛选将潜在靶点导入STRING 数据平台(https://string-db.org/cgi/),设置物种为“Homo Sapiens”,置信度“medium confidence(0.4)”,获得PPI模型及相关文本及表格,把结果以TSV格式导出。借助Cytoscape 3.7.2软件,将PPI网络可视化,并根据Degree值筛选出关键靶点。

1.5 富集分析将潜在靶点上传至DAVID数据库(http://david.ncifcrf.gov),限制物种为“Homo Sapiens”,进行基因本体(gene ontology,GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路富集分析。结果根据FDR值<0.05进行筛选,根据LogP值大小对结果进行排序,LogP值越小,作用关系越强烈。

1.6 关键活性成分与核心靶点分子对接验证从TCMSP数据库中下载关键成分3D结构图的MOL2格式,利用Open Babel软件将其转换为pdb格式,从蛋白质数据库(protein data bank,PDB,https://www1.rcsb.org/)中获得核心靶点的pdb格式文件,将其导入AutoDock Tool 1.5.6软件中进行处理分析。一般认为,结合能绝对值>4.25 kcal·mol-1则表示大分子蛋白与小分子配体之间结合活性良好。最后将对接结果在Pymol软件中进行可视化处理,并以图片形式展现。

2 结果

2.1 药物活性成分及其相关作用靶点通过TCMSP数据库查询,符合筛选标准且能查询得到对应靶点的活性成分共50种,其中苍术4种、黄柏24种、牛膝16种、薏苡仁6种。成分对应靶点去重后最终获得215个靶点。

2.2 疾病靶点利用DrugBank、OMIM、GeneCards数据库检索疾病相关靶点,整理后共获得2 291个AS靶点,774个HUA靶点。

2.3 “药物-有效成分-潜在靶点-疾病”网络将药物相关靶点和疾病靶点输入在线工具Venny 2.1.0 绘制韦恩图,共获得36个交集靶点,即为四妙丸异病同治AS与HUA的潜在靶点,见图1,其中36个潜在靶点对应27种药物有效成分。将潜在靶点及其对应的活性成分、药物、疾病名称导入Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-有效成分-潜在靶点-疾病”网络,SMV为四妙丸,见图2。根据Degree值筛选出四妙丸作用于AS和HUA的关键成分(前10位),见表1。

表1 四妙丸治疗AS和HUA主要活性成分及其参数

图1 四妙丸成分靶点与AS、HUA靶点韦恩图

图2 “药物-有效成分-潜在靶点-疾病”网络图

2.4 PPI网络与核心靶点将从STRING数据库平台获得的PPI相关文本及表格导入Cytoscape 3.7.2软件绘制PPI网络,得到含169个节点和929条边的网络图。根据Degree值设置节点大小和颜色深浅,Degree值越大,节点越大,颜色越深,见图3。图中白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)与其他靶点联系最多,其次是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、IL-1β、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、前列腺素内过氧化物合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARG)、CXCL8(IL-8)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1,CCL2)、IL-10等。

图3 潜在靶点PPI网络图

2.5 GO富集分析与 KEGG通路富集分析利用DAVID数据库进行GO富集分析和KEGG信号通路富集分析,将结果以Excel表格形式导出,筛选排序后,GO富集分析共获得生物过程(biological processes,BP)137条、细胞组成(cellular components,CC)7条及分子功能(molecular functions,MF)15条,其中BP主要富集在基因表达的正向调控(positive regulation of gene expression),转录的正向调控、DNA依赖(positive regulation of transcription,DNA-templant),RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正向调控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter),炎症反应(inflammatory response),脂质储存负调控(negative regulation of lipid storage)等;CC主要富集在细胞外空间(extracellular space)等;MF主要富集在细胞因子活性(cytokine activity)、相同蛋白结合(identical protein binding)、转录因子结合(transcription factor binding)、酶结合(enzyme binding)等。选取各项前5条绘制气泡图,见图4。KEGG富集分析结果共获得100条通路,选取排名前20名的通路绘制气泡图,分析发现交集靶点主要富集在糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化、疟疾、IL-17信号通路、TNF信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、恰加斯病(美国锥虫病)、利什曼病、类风湿性关节炎信号通路、炎症性肠病、NF-κB信号通路等,见表2及图5。以上结果体现四妙丸防治AS和HUA是多途径的。

表2 交集靶点KEGG通路富集分析

图4 GO富集分析

图5 KEGG通路富集分析

2.6 关键活性成分与核心靶点分子对接验证通过AutoDock Tool 1.5.6软件对四妙丸中关键活性成分槲皮素、山柰酚、汉黄芩素与核心靶点IL-6、TNF、IL-1β进行对接,结果显示,活性成分与核心靶点的结合能绝对值集中在4.37～7.9 kcal·mol-1,说明两者之间均存在良好的结合活性。对接结果见表3、图6。

表3 关键活性成分与核心靶点分子对接结合能 (kcal·mol-1)

3 讨论

AS是免疫相关疾病,HUA是代谢相关疾病,病因虽不同,但二者均存在炎症反应、氧化应激反应,均有脾肾亏虚,湿热内蕴的病机特点。AS患者中HUA发生率较高[13-14],同时,尿酸水平过高可能会抑制Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ech-associated protein 1,Keap1)-核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)信号通路活化,增加氧化应激损伤,从而加重AS患者的炎症反应[15]。Chen等[16]发现,中国AS患者尿酸水平与骨密度成倒“U型”相关,将尿酸浓度控制在300～360 μmmol·L-1有助于预防患者的骨质疏松。四妙丸具有清热利湿、舒筋壮骨之功,具有调节免疫、抗炎抑菌、镇痛、抗氧化、促进尿酸排泄等作用[17]。

本研究分析了四妙丸治疗AS和HUA交集靶点的PPI网络,得到IL-6、TNF、IL-1β、VEGFA、PTGS2等核心靶点。研究表明,它们与炎症、免疫、血管生成、代谢密切相关。IL-6、TNF、IL-1β均为炎性细胞因子,在免疫和炎症反应中发挥重要作用。临床发现,AS及HUA患者体内IL-6、TNF和IL-1β的表达高于正常水平,影响疾病的发生发展[18-19]。IL-6可以调节辅助性T细胞17(helper T cell,Th17)和调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)之间的平衡。Th17参与自身免疫性疾病的发生,而Treg具有免疫抑制作用,因此,Th17/Treg平衡维持了机体的免疫稳态。IL-6与转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)结合可以促进Th17分化,并抑制TGF-β诱导的Treg分化;若IL-6过度表达则会导致Th17/Treg失衡,IL-17、IL-23等炎症因子水平升高,进而促进AS及HUA的发生发展[20-22]。TNF在体内有α和β两种结构,其中TNF-α能够激发炎症级联反应,诱导多种炎症因子如IL-1β、IL-6表达上调,使炎症迅速扩大并持续存在[23]。TNF-α还能增加破骨细胞分化因子(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)的表达并诱导产生Wnt信号通路抑制剂DKK-1和硬化蛋白SOST,引起骨质侵蚀,抑制骨形成,造成骨质破坏[24]。临床治疗显示,靶向TNF是治疗AS的有效策略[25]。IL-1β可与自身受体结合激活 IL-1 信号通路和核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB),诱导释放 IL-6、IL-8 和 IL-17a,引起炎症反应。此外,IL-1β 能够增加促氧化酶和黄嘌呤氧化酶的表达,产生更多的超氧化物,导致内皮细胞功能异常[26]。王海波等[27]发现,HUA大鼠TNF和IL-1β水平显著高于空白大鼠,且显著低于药物治疗大鼠,说明药物可以通过抑制TNF和IL-1β表达有效缓解HUA。VEGFA是一种血管内皮细胞生长因子,能够诱导血管生成以及内皮细胞增殖、增加血管的通透性,导致滑膜炎症和骨质破坏,进而参与AS病理发展过程[28]。研究发现,在HUA状态下,microRNA-92a(miR-92a)表达下调,其靶基因KLF2表达增加并与VEGFA启动子结合抑制VEGFA,从而损伤血管内皮功能引起心血管疾病,推测miR-92a-KLF2-VEGFA可能是HUA的治疗靶点[29]。PTGS2即环氧合酶2(COX-2),受NF-κB调节,在前列腺素生物合成中发挥关键作用,而前列腺素能够调节血管张力、细胞增殖分化、炎症疼痛和能量代谢[30]。非甾体抗炎药可以通过抑制COX活性减少前列腺素生成来治疗AS[31]。有研究显示,较高水平的尿酸具有直接的促炎作用,可诱导 COX-2 表达和前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)合成,引发组织炎症,而选择性的COX-2抑制剂具有显著降低尿酸的作用[32]。

通过分析“药物-有效成分-潜在靶点-疾病”网络可知,槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、β-谷甾醇、芸香碱、黄芩素等为四妙丸发挥疗效的关键成分。分子对接显示,这些成分与核心靶点结合活性良好,进一步说明四妙丸中槲皮素、山柰酚、汉黄芩素等成分可作用于IL-6、TNF等靶点,对AS和HUA发挥作用。槲皮素、山柰酚是天然的黄酮类化合物,具有抗炎抑菌、抗氧化、抗血小板聚集和清除自由基等药理特性[33]。Le等[34]发现,槲皮素能够降低炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-17和 MCP-1 水平,抑制巨噬细胞浸润,抑制滑膜细胞的异常增生,减弱炎症反应,保护骨组织,对炎性疾病有积极的作用。NF-κB通过激活包括TNF-α、IL-6、IL-8、COX-2和iNOS在内的炎症介质参与AS和HUA的发展过程,且其可受抑制剂IκB-α抑制并驻留在细胞质中,直到它被炎症刺激触发[35]。KIM等[36]发现,AGE的产生及其与其受体RAGE的结合诱导IκB-α的降解,从而诱导大鼠衰老时 NF-κB 的表达,对这些大鼠用山柰酚进行治疗时可有效抑制IκB-α的降解并减少NF-κB的活化。此外,郝悦等[37]通过改良的HPLC法对30种抑制黄嘌呤氧化酶XOD活性的黄酮进行测定,发现槲皮素、山柰酚的作用最强,可明显抑制XOD的活性,从而表现出降尿酸的作用。汉黄芩素和黄芩素均可以抑制IL-1β 诱导的 IL-6 、TNF-α、IL-8的产生而发挥抗炎、调节免疫的作用[38]。汉黄芩素还是一种全方位的VEGF信号抑制剂,能有效降低血清中VEGF的浓度[39]。黄芩素还能干扰花生四烯酸的代谢通路,降低PGE2分泌、核因子活性以及细胞因子分泌,从而发挥一定的解热镇痛抗炎作用[40]。β-谷甾醇被认为是重要的植物甾醇化合物,对炎症性、免疫性相关疾病同样具有显著疗效。临床试验证实,β-谷甾醇在免疫应激状态下,能提高抗炎因子IL-10的表达水平,并可通过抑制 NF-κB 信号转导,降低TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子的表达[41]。

查阅相关文献结合KEGG富集分析发现,糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化、IL-17信号通路、TNF信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、炎症性肠病等信号通路为四妙丸发挥作用的关键通络。AGE与RAGE配体结合,可激活NADPH氧化酶Nox和NF-κB,促进氧化应激和炎症循环。HUA患者血清RAGE水平与血清尿酸呈正相关,尿酸水平过高会增强高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)的生成和释放,增加氧化应激并激活 RAGE 信号通路,导致内皮功能障碍[42-43]。HUA是心血管疾病的危险因素,AS患者同时诊断出动脉粥样硬化、血脂异常的概率高于正常人群,这可能与炎症反应通过各种炎症介质如IL-6、TNF-α、IL-1β 以多种方式影响新陈代谢和心血管系统有关[44]。近年来研究发现,肠道菌群稳态失衡与机体炎症反应密切相关,能够诱导并加重诸如AS和HUA等炎症性疾病[45]。同时,尿酸水平的高表达也会反向诱发机体及肠道的炎症反应,改变肠道内环境[46]。大量研究已经证实,IL-17信号通路和TNF信号通路与炎症、免疫反应及骨质破坏有关。

综上所述,本研究运用网络药理学的方法对四妙丸治疗AS及HUA的可能作用机制进行了分析,结果显示,四妙丸主要通过槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、β-谷甾醇、芸香碱、黄芩素等活性成分作用于IL-6、TNF、IL-1β、VEGFA、PTGS2等关键靶点,通过多种生物过程介导多条通路发挥抗炎、抗氧化、解热镇痛、调节免疫与代谢、疏通血管、促进尿酸排泄等作用,从而达到异病同治AS与HUA的疗效,但后续还需要进行进一步实验验证。