墨兰CsAP1-A 基因克隆及表达分析

周 荣，刘嘉超,，杨凤玺

（1.佛山科学技术学院，广东 佛山 528000；2.广东省农业科学院环境园艺研究所/广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室，广东 广州 510640）

【研究意义】墨兰（Cymbidiumsinense）是我国国兰的典型代表之一，在福建、广东、台湾广泛分布。墨兰叶型独特，花姿优美，花香馥郁，花期长（9 月至翌年3 月），具有很高的观赏价值和经济价值［1-3］，产品远销韩国、日本等地。开花性状是墨兰最重要的育种目标，而APETALA1（AP1）基因在植物成花转变和花器官发育过程中具有非常关键的作用［4］。开展墨兰AP1基因的克隆和表达分析研究，对探究墨兰开花过程中的分子调控机制具有重要意义。【前人研究进展】MADS-box 基因家族是一类在植物中广泛存在的转录因子家族，可与其他转录因子和调控因子相互作用，共同在植物花器官分化、果实发育和开花调控等方面起作用。MADSbox 基因家族通常分为两个亚家族（Type Ⅰ和Type Ⅱ），其中Type Ⅱ亚家族基因编码的蛋白质均有1 个特征性结构域K，能够折叠形成3 个α螺旋结构，介导MADS-box 蛋白之间形成二聚体，通过蛋白复合体共同调控下游靶基因。以Type Ⅱ类MADS-box 基因为核心构成的花发育ABCDE模型决定植物花器官的发育［5-6］。A 类基因主要影响花朵的外轮花器官发育，同时与E 类基因共同参与萼片的发育，并与B 类基因和E 类基因共同调控花瓣的形成和特化。AP1属于A 类基因，其突变或过表达都会对植物的开花时间和花器官产生显著影响［7-8］。在拟南芥中，过表达AP1可使拟南芥提前1 周左右开花［9］。AP1同时可以抑制最外轮花器官萼片叶腋处形成更多花原基。另外，AP1可以分别通过抑制细胞分裂素合成基因和激活细胞分裂素降解酶，减少AP1基因表达区域的细胞分裂素含量，从而维持正常花分生组织的有限生长。目前，建兰（C.ensifolium）［10］、石 斛（DendrobiumChao Praya Smile）［11］、萼脊兰（Sedireajaponica）［8］、牡丹（Paeonia suffruticosa）［12］、荔枝（Litchichinensis）［13］、大豆（Glycinemax）［14］等多种植物的AP1基因已被成功克隆，研究发现，它们在花器官的形成和花期调控中起着非常重要的作用。【本研究切入点】目前关于墨兰AP1基因的研究报道甚少，该基因在墨兰上的功能表现也尚未清楚。因此，本研究以墨兰为研究对象，克隆并鉴定到1 个墨兰AP1基因（命名为CsAP1-A），并进行基因表达模式分析［15］。【拟解决的关键问题】本研究克隆墨兰CsAP1-A基因，通过生物信息学分析其基因结构、蛋白结构域和进化关系，利用RTqPCR 方法分别检测CsAP1-A在墨兰不同器官、不同花发育阶段和不同花组织部位的表达情况，通过转录组测序分析CsAP1-A在5 个不同花型墨兰品种花组织部位的表达情况，并采用蛋白互作预测软件分析CsAP1-A 与其他蛋白的互作关系，为进一步研究CsAP1-A 在墨兰花发育过程的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

基因克隆、表达分析供试的墨兰品种为‘小香’，栽培于广东省农业科学院环境园艺研究所国家墨兰种质资源圃内。挑选3 株长势良好的墨兰，采集其花芽、成熟花器官及根、茎、叶和果各3 g 左右，用液氮速冻，-80 ℃保存备用。

不同花型转录组测序分析供试的5 个墨兰品种为‘瑞金’（WT 普通花型）、‘安康梅’（花瓣蕊柱化的梅瓣花型，Gynostegium-like petal variety，GPV）、‘大圣’（重瓣花型，Multi perianth variety，MPV）、‘金凤蝶’（花瓣唇瓣化花型，Labellum -like petal variety，LaPV）和‘六瓣花’（唇瓣萼片化花型，Null-labellum variety，NLV），均来源于广东省农业科学院环境园艺研究所国家墨兰种质资源圃。采集的花朵立即用液氮速冻处理。

DH5α 化学感受态细胞、荧光定量试剂盒（Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix）、高保真酶试剂盒（2×Phanta Flash Master Mix）、产物纯化试剂盒（FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit）、克隆载体试剂盒（5 min TA/Blunt Cloning Kit）和RNA 提取试剂盒（FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit），均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 总RNA 提取及反转录

用多糖多酚植物RNA 提取试剂盒提取墨兰花芽的RNA，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。使用蛋白核酸分析仪检测RNA 浓度，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 质量，将检测合格的RNA 进行反转录反应得到cDNA。

1.3 目的基因克隆

以前期基因组测序得到的CsAP1-ACDS 为参考序列，使用NCBI 设计基因克隆的PCR 引物：CsAP1-A-F 5'ATGGGAAGAGGGAGGGTT3'、CsAP1-A-R 5'TTATCCATTCATATGAGTGAGC3'。以墨兰花芽cDNA 为模板，按照高保真酶试剂盒说明书操作进行CsAP1-A基因克隆，PCR 体系为50 μL，反应程序：98 ℃预变性30 s；98 ℃预变性10 s、58 ℃退火5 s、72 ℃延伸5 s，34 个循环；72 ℃延伸1 min。扩增产物回收纯化后与TA 克隆载体连接，转化到DH5α 化学感受态细胞中培养，次日挑选阳性菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，得到CsAP1-A基因完整序列。

1.4 CsAP1-A 生物信息学分析

使用Expasy-ProtParam（https://www.expasy.org/）分析CsAP1-A 蛋白的分子量大小、亲水性等理化性质；使用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析CsAP1-A 的保守结构域；使用DNAMAN 软件将CsAP1-A 与6 个同源蛋白进行多序列比对；使用Mega6.0 软件的邻接法构建CsAP1-A 系统进化树。

1.5 CsAP1-A 基因表达分析

使用RT-qPCR 方法对CsAP1-A在墨兰不同器官（根、茎、叶、花、果）、不同花发育阶段（花芽分化初期S1、花芽分化发育期S2、花梗伸长期S3、排铃期S4 和开花期S5）和不同花组织部位（萼片、花瓣、唇瓣、合蕊柱）的表达进行分析。以CsActin作为内参基因（表1），PCR 反应程序为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40 个循环。基因表达试验重复3 次，使用2-ΔΔCt公式计算CsAP1-A相对表达量［16］。

表1 CsAP1-A 基因荧光定量PCR 引物Table 1 Primers for fluorescence quantitative PCR of CsAP1-A gene

1.6 不同花型转录组测序分析

采集5 个不同花型（WT、GPV、MPV、LaPV、NLV）墨兰品种（‘瑞金’‘安康梅’‘大圣’‘金凤蝶’‘六瓣花’）的花朵，立即液氮速冻处理，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行转录组测序。对CsAP1-A的FPKM 值进行log2转换，并利用R 语言中的Pheatmap 工具包生成热图。

1.7 CsAP1-A 蛋白互作关系

通过STRING 数据库（https://cn.string-db.org/）预测可能与CsAP1-A 发生互作的蛋白质，并以水稻作为参考，构建CsAP1-A 与其他蛋白的互作关系图。

2 结果与分析

2.1 CsAP1-A 基因全长克隆

以墨兰花芽为材料提取RNA，并将RNA 反转录为cDNA。以cDNA 为模板，以墨兰基因组参考序列设计引物，扩增得到约750 bp 的单一片段（图1）。将回收的DNA 片段与TA 克隆载体进行连接并转化感受态细胞，最后通过测序得到CsAP1-A基因序列，全长744 bp，编码248 个氨基酸（图2）。

图1 CsAP1-A 基因克隆PCR 产物Fig.1 PCR product of CsAP1-A gene cloning

图2 CsAP1-A 基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide acid sequence of CsAP1-A gene and deduced amino sequence

2.2 CsAP1-A 生物信息学分析

2.2.1 CsAP1-A 蛋白理化性质分析根据Expasy-ProtParam 预测分析结果，CsAP1-A 蛋白的分子式为C1242H2038N370O376S9，蛋白分子量为28.4 kD，总原子数为4 035，脂肪系数为83.40，平均亲水性为-0.762，说明CsAP1-A 是一个亲水蛋白。选择模型一致性高达98.38%的同源蛋白AOA1P8SCC5.1A 作为模板，通过SWISS-MODEL在线软件构建CsAP1-A 蛋白的三级结构，发现该结构包含4 个保守的α-螺旋和2 个β 折叠结构（图3）。

图3 CsAP1-A 蛋白三级结构预测Fig.3 Tertiary structure prediction of CsAP1-A protein

2.2.2 CsAP1-A 蛋白保守域分析与同源序列比对 通过NCBI 数据库分析蛋白序列可知，CsAP1-A 拥有保守的MADS-box 结构域和K-box结构域（图4），属于MADS-box转录因子家族成员。此外，通过NCBI 数据库得到多个与CsAP1-A 同源性很高的蛋白序列，其中，CsAP1-A 与春兰（C.goeringii）AP1/FUL（APY18447.1）和蕙兰（C.faberi）MADS1（AGE15496.1）的同源性均高达98.38%，与金钗石斛（D.nobile）MADSbox protein 1（ABQ08573.1）、蝴蝶兰（Phalaenopsis amabilis）AP1-related protein（AAZ76263.1）、华山姜（Alpiniaoblongifolia）APETALA1-like protein（ABS83558.1）、银合欢（Nelumbonucifera）APETALA1（AGY54940.1）的同源性分别为85.83%、82.19%、66.27%和60.32%（图5）。

图4 CsAP1-A 蛋白保守结构域分析Fig.4 Analysis of conserved domains of CsAP1-A protein

图5 CsAP1-A 蛋白同源序列比对Fig.5 Homologous sequence alignment of CsAP1-A protein

2.2.3 CsAP1-A 氨基酸序列的系统进化 为进一步了解CsAP1-A 蛋白的系统进化情况，从NCBI数据库中挑选20 条与CsAP1-A 氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列，利用MEGA6.0 软件的NJ 法构建进化树。结果（图6）表明，CsAP1-A的进化树可以分为单子叶植物和双子叶植物两类［17］，其中在单子叶植物中，CsAP1-A 与其他兰科植物亲缘关系较近，并聚类一起。

图6 CsAP1-A 蛋白NJ 系统进化树Fig.6 Neighbor-joining phylogenetic tree of CsAP1-A protein

2.3 CsAP1-A 基因时空表达分析

为研究CsAP1-A的表达模式，用RT-qPCR方法分别检测其在墨兰根、茎、叶、花、果不同器官，不同花发育阶段，以及萼片、花瓣、唇瓣、合蕊柱不同花朵组织部位的表达情况。结果（图7）表明，CsAP1-A在墨兰不同器官中均有表达，在花中表达量最高，其次分别为茎、果、根和叶。

图7 CsAP1-A 在墨兰不同器官中的相对表达量Fig.7 Relative expression of CsAP1-A in different organs of Cymbidium sinense

在墨兰花芽分化发育的不同阶段，CsAP1-A集中在花发育早期阶段表达，在S1阶段的表达量最高，之后逐渐下降，在S3 阶段的表达量降至60%，在S5 阶段的表达量降至最低。此外，对墨兰不同花组织部位的表达分析发现，CsAP1-A在合蕊柱中的表达量最高，其次分别是唇瓣、花瓣和萼片（图8）。

图8 CsAP1-A 在墨兰花中的相对表达量Fig.8 Relative expression of CsAP1-A in flower of Cymbidium sinense

2.4 不同花型墨兰CsAP1-A 表达模式分析

分析墨兰不同花型转录组数据集，用热图形式显示不同花型CsAP1-A基因的表达情况。结果（图9）表明，CsAP1-A在WT、MPV、LAPV 和NLV 4 种花型［18］中均以合蕊柱中的表达量最高、萼片中的表达量最低；在合蕊柱异常发育的MPV中，CsAP1-A在合蕊柱的表达量显著提高，而在GPV 中的整体表达量最高，且表达区域从合蕊柱扩展到花瓣。

2.5 CsAP1-A 蛋白互作预测分析

使用String 在线网站预测CsAP1-A 蛋白与其他蛋白之间的互作可能性，并以水稻作为参考，结果（图10）表明，CsAP1-A 可能与MADS1（A类基因）、MADS6（D 类基因）、MADS47（B 类基因）、MADS8（C 类基因）等10 个蛋白存在互作关系。MADS1 与MADS47 的综合得分较高，推测CsAP1-A 与它们互作的可能性更大。而在水稻中，OsMADS1 和OsMADS6 蛋白均属于MADSbox 转录因子家族成员，且这些蛋白在花器官发育和花期调控方面发挥重要作用［19］。因此，推测CsAP1-A 蛋白参与墨兰花的发育。

图10 CsAP1-A 蛋白互作关系预测Fig.10 Prediction of CsAP1-A protein interactions

3 讨论

MADS-box 转录因子在调控植物花的形态和发育过程方面扮演着重要角色，而AP1基因是MADS-box 转录因子家族的重要成员，被归类为拟南芥ABCDE 开花模型中的A 类基因，在许多植物中均被证实能够发挥调控植物开花、调控花器官发育的作用［20］。五峰玉兰MawuAP1基因可以使拟南芥提前开花，并在花序顶端产生顶生花［21］。过表达麻风树JcAP1基因能够显著缩短拟南芥的生长周期并导致提前开花［22］。过表达月季RcAP1也可以使拟南芥提前开花［23］。

本研究从墨兰花芽中克隆出CsAP1-A基因，该基因编码区为744 bp，编码248 个氨基酸，含有MADS-box 和K-box 结构域，表明CsAP1-A是典型MADS-box 转录因子。通过与其相似度较高的蛋白进行多序列比对，发现它们的保守结构域相同。系统进化树分析表明，CsAP1-A 蛋白与春兰AP1/FUL3 蛋白聚为一支，说明二者亲缘关系最近。

大多数A 类基因在生殖器官的表达量均高于营养器官［24］。本研究比较了CsAP1-A基因在墨兰根、茎、叶、花、果5 个器官的相对表达量，发现CsAP1-A在花中的表达量最高，在其他器官的表达量较低，说明CsAP1-A与花的发育和形成有关。在墨兰花芽分化的5 个时期中，CsAP1-A在花芽分化初期（S1）的表达量最高，然后逐渐下降，在开花期（S5）的表达量降到最低，这与大部分的A 类基因在不同花发育时期表达规律相似，如山茶的CjAPL1［25］、麻风树的JcAP1［22］和洋桔梗的EgAP1［26］，因为S1 期是花器官形成的起始阶段和关键阶段，AP1作为一个转录因子，可以在此阶段启动信号来激活其他基因促进花的形成，而随着花芽的不断发育，其他相互作用的调控因子和信号通路逐渐介入，AP1的表达量就会逐渐降低。在墨兰花朵的不同组织部位中，CsAP1-A在合蕊柱的表达量最高，其次是唇瓣，推测CsAP1-A主要参与墨兰合蕊柱的发育。对墨兰不同花型进行转录组测序分析，发现CsAP1-A在WT、MPV、LaPV 和NLV 4 种花型的合蕊柱中表达量均最高，这与RT-qPCR 检测WT 花型中CsAP1-A的表达结果相一致。AP1作为A 类基因主要在第一、二轮花器官中表达，诱导花瓣和萼片的发育［7］；但在兰科植物中，AP1不在第一、二轮花器官表达，而是在内轮的合蕊柱中表达［27］。

根据蛋白互作关系的预测结果可知，CsAP1-A 大多与MADS-box 蛋白家族存在相互作用，而这些蛋白均与花器官发育和花期相关，因此预测CsAP1-A 蛋白在墨兰花器官发育过程中起重要作用，这为进一步研究墨兰花器官发育分子调控机制提供理论依据。

4 结论

本研究在墨兰花芽中克隆得到CsAP1-A基因，该基因编码248 个氨基酸，含有MADS-box转录因子家族的MADS-box 和K-box 结构域。墨兰CsAP1-A与春兰和蕙兰的亲缘关系最近，且可能与MADS1、MADS6、MADS47、MADS8 等蛋白具有相互作用。CsAP1-A在墨兰花中的相对表达量显著高于其他器官，且在花芽分化初期的表达量最高，并随着花朵发育而逐渐下降；在墨兰花朵不同组织部位中，CsAP1-A在合蕊柱的表达量最高，其次是唇瓣、花瓣和萼片。通过对不同花型的墨兰品种转录组测序发现，CsAP1-A在WT、MPV、LaPV 和NLV 4 种花型的合蕊柱中表达量均最高。综上所述，CsAP1-A可能在墨兰花发育和合蕊柱形成中具有重要作用。