基于SSR标记的12个非洲菊品种指纹图谱构建及杂交F1后代鉴定

刘小飞，于 波，任桂萍，余超然，刘 冲，孙映波，钟荣辉，冯恩友

（1.广东省农业科学院环境园艺研究所/广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室/农业农村部华南都市农业重点实验室，广东 广州 510640；2.湛江市农业科学研究院/广东省农业科学院湛江分院，广东 湛江 524003；3.云南大学生命科学学院，云南 昆明 650500；4.广东省农业科学院蔬菜研究所/广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广东 广州 510640；5.广东省农业科学院农业资源与环境研究所，广东 广州 510640）

【研究意义】非洲菊（Gerberahybrida）是菊科扶郎花属多年生常绿草本植物，别名扶郎花、舞娘花、灯盏花［1］，原产于南非，在温度适宜的条件下可周年开花，具有很高的观赏价值，是世界十大切花之一［2-3］，园艺品种繁多，商品名称易混淆，不利于种质资源的收集与鉴评。因此，开发适用于非洲菊种质资源鉴评的分子标记，可实现对非洲菊种质资源的快速鉴评，为非洲菊新品种选育奠定基础。【前人研究进展】目前，在三色堇［4］、桂花［5］、牡丹［6］、山茶［7］和三角梅［8］等花卉中均已开发出相应的SSR 标记，但有关非洲菊SSR 标记开发的报道尚较少［9-10］。林发壮等［9］对非洲菊‘云南红’转录组序列的SSR位点进行挖掘，发现其SSR 位点丰富，分布密度大，具有较高的多态性潜能，可作为开发SSR 标记的有效来源。在菊属种质资源遗传多样性研究中，SSR 分子标记技术应用广泛。肖雨沙等［11］对南美蟛蜞菊转录组测序得到的23 338 个SSR 位点设计引物，随机选择200 对引物进行扩增实验验证，有效扩增55 对，其中6 对引物特异性高，重复性好。宋江琴等［12］基于表型性状和SSR 标记的9 份万寿菊种质遗传多样性分析发现9 个材料具有较高的遗传多样性，且两种聚类结果总体上较为一致。丁红旭［13］对菊花全长转录组测序结果开发 的SSR 标记进行综合研究，发现这些标记在菊花全长转录组5'UTR 区扩增多态性最高，且部分SSR 与对应性状相关联，菊花插穗再生植株和组培苗中SSR 标记的多态性受5-氮杂胞苷（5-Azacytidine，5-azaC）或甲基磺酸乙酯（Ethyl methane sulfonate，EMS）处理影响。Yuan 等［14］基于SSR 标记多态性对中国菊花品种进行鉴定和分类，为菊花种质资源鉴评奠定了良好基础。【本研究切入点】目前非洲菊SSR 标记的开发和应用尚不多见，有关SSR 标记在非洲菊种质资源鉴评和杂交后代快速鉴定中的应用研究仍较少。【拟解决的关键问题】综上，本研究采用18 对SSR标记对12 份非洲菊种质进行亲缘关系分析，构建其指纹图谱，并对部分品种的杂交后代的真假杂种进行鉴定，筛选出可用于非洲菊分子育种的SSR 荧光标记引物，以期为非洲菊种质资源鉴评及创新利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2021 年12 月25 日，于湛江市农业科学研究院从云南宽霆生物科技有限公司购买11 份非洲菊种质（表1）的种苗，7 d 后移栽至直径5 cm 的黑色种植袋，放于大棚苗床上培养，培养温度为25～30 ℃，45 d 后移栽至广东省农业科学院环境园艺研究所上盆培养；同时从华南师范大学引种‘深圳5 号’（第12 份种质），培养温度同上。2022 年2 月14 日，取2 月苗龄的非洲菊幼嫩叶片为材料，-80℃保存备用。受检的杂交后代以紫水晶（Gerberahybrida‘Zishuijing’）为母本，以粉佳人（Gerberahybrida‘Fenjiaren’）为父本，获得杂交F1代2 个单株（Gh-1 和Gh-4）；以粉佳人为母本，以紫水晶为父本，获得杂交F1代1个单株（Gh-5），2023 年7 月13 日，取播种后6月苗龄杂交苗幼嫩叶片为材料，-80 ℃保存备用。

表1 供试材料Table 1 Information of 12 G.hybrida germplasms 12 份非洲菊种质信息

试验用试剂：TaqPlus DNA 聚合酶（B600090，生工生物工程股份有限公司），POP-7TMPolymer〔4363785，ThermoFisher（Applied BiosystemsTM）〕，HiDiFormamide〔4311320，ThermoFisher（Applied BiosystemsTM）〕；其他常用试剂均由生工生物工程股份有限公司提供。

主要仪器：PCR 仪（VeritiTM96well，美国ABI），凝胶成像仪（FR-980A，上海复日科技有限公司），测序仪（3730XL，美国ABI），台式高速离心机（TD5A-WS，湖南湘仪实验仪器开发有限公司），电泳仪（DYY-6C，北京六一仪器厂），电泳槽（DYCP-32B，北京六一仪器厂），UVVis Spectrophotometer（SMA4000，Merinton）。

1.2 DNA 提取

使用Ezup 柱式植物组织基因组DNA 抽屉试剂盒（生工生物工程股份有限公司，B518261），参考刘小飞等［15］方法进行提取，提取DNA 后电泳检测DNA 质量，并保存于-20 ℃备用。

1.3 引物合成

从非洲菊‘香槟’（Gerberahybrida‘Champagne’）转录组（SRA accession：PRJNA378315）测序得到的SSR 标记中随机挑选出2 碱基和3碱基重复类型的SSR 标记，设计引物（表2），初筛后，选择条带清晰且多态性好的引物合成带M13 标记（正向引物，序列为：5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'）的荧光引物，荧光标记6-FAM（蓝色）、HEX（绿色）、TAMRA（黑色）和ROX（红色）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 SSR 引物序列Table 2 SSR primer sequences

1.4 PCR 反应体系及程序

PCR 反应体系：10×TaqBuffer（含Mg2+）2.5 μL，20～50 ng/μL 模板DNA 1 μL，10 μmol/L 正向引物 0.5 μL，10 μmol/L 反向引物 0.5 μL，10 μmol/L dNTP（mix）0.5 μL，5 U/μLTaq酶0.2 μL，以ddH2O 补足25 μL。PCR 反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，2～4 个循环；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30 个循环；72 ℃ 10 min。

1.5 毛细管电泳检测SSR 标记荧光引物的多态性

参考白松等［16］方法，使用ABI 测序仪（3730 xl）对扩增结果进行检测。

1.6 数据分析

使用Genemapper 软件分析SSR 数据，使用Excel 进行常规分析。指纹图谱编码方法参见文献［17］，UPGMA 聚类分析方法参见文献［18］。

2 结果与分析

2.1 SSR 引物筛选结果

提取12 份非洲菊种质的基因组DNA（图1）后，基于非洲菊‘香槟’转录组中筛选出50 对SSR 标记（表2），以每对引物PCR 扩增4 个样品进行初筛。电泳结果（图2）显示，GHSSR-1/6/9/10/13/14/16/17/18/20/21/24/25/30/36/38/39/43共计18 对引物的扩增条带清晰，多态性较好，合成带M13 标记（正向引物）的荧光引物（表3）用于后续试验。

图1 12 份非洲菊种质基因组DNA 提取电泳检测结果Fig.1 Genomic DNA extraction and electrophoresis detection results of 12 varieties of Gerbera hybrida

图2 基于50 个SSR 标记设计引物的PCR 扩增电泳结果Fig.2 Result of PCR amplification electrophoresis based on 50 SSR markers designed primers

表3 用于毛细管电泳的SSR 引物连接M13 接头情况Table 3 SSR primer connection M13 connector for capillary electrophoresis

2.2 18 对引物在12 份非洲菊种质扩增后的毛细管电泳结果

使用Genemapper 软件分析毛细管电泳结果发现，18 对引物共扩增出74 个等位位点，平均每对引物扩增4.1 个（表4）。其中，GHSSR-1、GHSSR-18、GHSSR-20 和GHSSR-21 多态性较好，分别扩增出9、7、7 和7 个等位位点，这4 对引物分别带有HEX（绿色）、6-FAM（蓝色）、6-FAM（蓝色）和ROX（红色）标记，SSR 标记类型均分别为AG（2*8）、TCT（3*5）、CA（2*6）和GT（2*6）。综上，该4 个SSR 标记设计的引物可作为核心引物用于指纹图谱构建。

表4 18 对引物在12 份非洲菊种质PCR 扩增后的毛细管电泳结果Table 4 Capillary electrophoresis results of 18 pairs of primers after PCR amplification in 12 varieties of Gerbera hybrida

2.3 12 份非洲菊种质指纹图谱构建

将4 对核心引物（GHSSR-1、GHSSR-18、GHSSR-20 和GHSSR-21）在12 个非洲菊品种中扩增的等位位点进行串联排列，得出对应的指纹图谱编码。结果表明，12 个非洲菊品种的编码均不相同，可有效对不同非洲菊品种进行区分（表5）。

表5 12 份非洲菊种质的DNA 指纹编码Table 5 DNA fingerprint code of 12 varieties of Gerbera hybrida

2.4 12 份非洲菊种质聚类分析

依据18 对引物在12 份非洲菊种质中的毛细管电泳结果进行UPGMA 聚类，结果显示，在遗传系数为0.75 时，可将12 个非洲菊品种分为5组：Ⅰ组包含3 个品种，分别是‘云南红’‘大088’和‘情人’；Ⅱ组包含4 个品种，分别是‘粉佳人’‘粉球’‘真爱’和‘福娃’；Ⅲ组包含3 个品种，分别是‘绣色’‘淑女’和‘黄球’；Ⅳ组包含1 个品种‘紫水晶’；Ⅴ组包含1 个品种‘深圳5 号’（图3）。

图3 12 份非洲菊种质UPGMA 聚类分析Fig.3 UPGMA cluster analysis of 12 varieties of Gerbera hybrida

2.5 部分非洲菊品种真假杂种鉴定

使 用GHSSR-18、GHSSR-20 和GHSSR-21 3对引物对‘紫水晶’和‘粉佳人’的杂交F1后代进行PCR 扩增，毛细管电泳检测结果显示，上述3 对引物鉴定出兼具双亲特异位点的单株分别是Gh-5、Gh-4 和Gh-1（表6、图4），单独1 对引物的鉴定率为33%。综合3 对引物的鉴定结果，发现受检的3 个单株均为真杂种，真杂种率为100%。

图4 3 株杂交F1 实生苗的扩增图谱Fig.4 Amplification maps of three hybrid F1 seedings

表6 不同 SSR 位点在杂交 F1 实生苗中的分布情况Table 6 Distribution of different SSR loci in hybrid F1 seedings

3 讨论

非洲菊具有较高的观赏价值，在盆栽方面亦有很大的发展潜力，但在我国难以获得种子，常规杂交育种时间长［19］，急需可缩短育种周期的技术体系。同时，从市场上收集的品种因无法有效了解其来源，为育种带来较大困扰。SSR 分子标记以其稳定、高效及多态性好的优点成为种质资源鉴评的重要手段［20-21］。王继华等［10］对来源于Plant genome Network 的非洲菊EST 序列SSR进行系统分析，发现SSR 重复单元中，富含A/T核苷酸的重复单元占据优势地位，而富含G/C 的重复单元在基因编码区中含量较低。冗余与非冗余的SSR 分布频率与密度相似，仅存在较小距差，说明可从现有的EST 数据中筛选出有效的微卫星标记。林发壮等［9］对非洲菊‘云南红’转录组序列的SSR 位点进行挖掘，发现14 928 个SSR 位点由73 种重复基序构成，（A/T）、（AG/CT、AC/GT）、（AAT/ ATT、AAG/CTT)分别是单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸优势重复基元，分别占总SSR 重复类型的62.31%、18.13%和6.93%。类似地，本研究所选用的50 对引物（表2）的SSR 重复单元中，富含A/T 核苷酸的重复单元也高于富含G/C 的重复单元。

非洲菊已有的SSR 分子标记研究中，多集中在SSR 位点信息［9］、SSR 频率和分布特点分析［10］等方面，在资源鉴评与创新利用方面的研究较少。本研究利用18 对扩增效果稳定的SSR 引物检测了12 份非洲菊种质，结果显示可以将其分为5组，其中，‘紫水晶’和‘深圳5 号’单独为一组，与‘粉佳人’亲缘关系较远，后续的杂交育种中将首先选用亲缘关系较远且观赏性状优良的‘紫水晶’和‘粉佳人’开展试验，也将选择‘紫水晶’和‘深圳5 号’为亲本开展不同的杂交组合，探索不同品种间的杂交亲和性及结实情况。同 时，以GHSSR-1、GHSSR-18、GHSSR-20 和GHSSR-21 4 对引物为核心，成功构建12 份非洲菊种质的指纹图谱，为非洲菊种质资源鉴评提供了可靠的SSR 荧光标记引物。在此基础上，利用GHSSR-18、GHSSR-20 和GHSSR-21 3 对引物对‘粉佳人’和‘紫水晶’的3 个杂交F1后代进行真假杂种鉴定，综合得出3 个杂交F1后代实生苗均为真杂种，初步建立了非洲菊杂交后代快速鉴定技术，为缩短非洲菊育种周期奠定基础。

4 结论

本研究从云南宽霆生物科技有限公司和华南师范大学生命科学学院共收集了12 份非洲菊种质，通过预实验筛选出18 对多态性较好的引物，合成带M13 接头的荧光引物。利用其检测12 份非洲菊材料，经毛细管电泳检测获得对应的多态性结果，聚类分析将其分为5 组。同时，借助GHSSR-1、GHSSR-18、GHSSR-20 和GHSSR-21等4 对核心引物构建了12 个非洲菊品种的指纹图谱。利用后3 对引物对‘粉佳人’和‘紫水晶’的杂交F1后代进行真假杂种检测，综合3 对引物的结果判断3 个单株均为真杂种。本研究为非洲菊种质资源鉴评和创新利用提供了可靠的SSR 荧光标记引物，同时，也为非洲菊杂交后代的快速鉴定提供了可用的技术体系。