野生香菇菌株鉴定及其与栽培菌株的生物学特性比较

李宏月，欧小云，刘 斌

（1.广西大学农学院/广西大学食用菌研究所，广西 南宁 530004；2.广东茂名农林科技职业学院生物技术系，广东 茂名 525000）

【研究意义】香菇（Lentinulaedodes）又名香蕈、冬菇，在分类归属方面一直存在许多探讨和争论，曾先后被归入过12 个不同的属，1983年从韧伞属Lentinus转入香菇属Lentinula，即担子菌纲（Basidiomycetes）伞菌目（Agaricales）光茸菌科（Omphalotaceae）香菇属（Lentinula），延续至今。中国是香菇第一大生产国，也是最大的消费国。据中国食用菌协会统计，2020 年我国香菇的总产量为1 188.21 万t，占食用菌总产量的29.25%，为我国食用菌年产量最大、创汇额较高的单品［1］。香菇野生种质资源主要分布在澳大利亚、日本、韩国、马来西亚、朝鲜、越南、泰国等国家，其中属日本记载最多［2］。我国香菇属的种类及分布较广，主要分布于热带及亚热带地区，温带地区较少［3］；野生香菇的多样性中心分布于西北和西南地区［2］。开展野生香菇种质资源的收集、鉴定和评价利用，挖掘优良野生香菇种质可促进香菇产业的发展［4］。分析对比野生香菇和栽培香菇的生物学特性，可为香菇优良品种的选育提供理论基础。【前人研究进展】我国香菇种质资源丰富，但香菇栽培品种的命名比较混乱，出现不少同名异物、同物异名等现象，因此香菇菌株的准确鉴定和命名极有必要。以往的香菇鉴定主要依赖形态学方法，但单纯的形态鉴定无法提供准确的物种信息［5］。目前认为形态学在食用菌鉴定中可作为辅助手段，但不能作为唯一的鉴定方法［6］。近年来基于分子标记的分子生物学鉴定方法应用越来越广泛［4,7］，由于此方法不易受外界环境的影响，具有特异性强、稳定性好、样品需求量少等特点，可直接利用菌丝体或子实体提取DNA 进行鉴定［8-10］。Song 等［11］研究表明，采用核糖体基因转录间隔区（Internal transcribed spacers，ITS）序列分析是鉴定香菇的理想分子标记。袁思明等［12］对采自云南的1 株野生香菇进行了鉴定和菌丝生长条件试验，其最适碳源为麦芽糖，最适氮源为牛肉膏。熊雪等［13］对分离自贵州马桑树的野生香菇进行生物学研究，该菌菌丝生长的最优碳源为蔗糖，最优氮源为蛋白胨，培养温度以23～25 ℃最优，最适pH 为7～10；方志荣等［14］研究了不同碳源、氮源、温度以及pH 对分离自四川的2株野生香菇菌株菌丝生长的影响，其最佳碳、氮源分别为玉米粉和酵母膏，最适培养温度为25 ℃，最适pH 为6.0；刘元涛等［15］通过单因素试验和正交试验的方法，研究中华小香菇生长发育过程中所需碳源、氮源等营养条件和温度、pH 等环境条件，从而得出其菌丝体生长的最佳条件。【本研究切入点】我国香菇种质资源丰富，但功能性栽培品种较少，目前缺少适宜在南方高温地区栽培的优良香菇品种。利用形态学和分子生物学鉴定方法，对香菇野生种质进行鉴定。【拟解决的关键问题】本研究旨在对采集自广西的2 株野生香菇菌株进行分离、鉴定，通过与香菇主要栽培菌株的生物学特性进行比较研究，探讨分析影响香菇菌丝生长的因素，在此基础上，根据不同菌株的综合表现，以期筛选出适宜当地高温气候条件的香菇种质资源和育种材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试野生菌株林香18（LX18）、林香19（LX19），栽培菌株L12、L26 和L808，均由广西大学食用菌研究所提供，其中LX18、LX19 由采集于广西上林县大明山的野生子实体分离获得。申香34（SX34）、申香60（SX60）和浦香08（PX08）由上海市农业科学院食用菌研究所陈明杰研究员惠赠。

PDA 培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，水1 000 mL。

基本培养基：葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.1%、琼脂1.5%、水1 L、pH 自然。

1.2 试验方法

1.2.1 形态鉴定 香菇子实体由菌盖、菌柄和菌褶组成。通过观察子实体的外观特征，如子实体大小、菌盖表面平整度、菌盖厚薄、菌柄长度、菌盖颜色、菌褶、菌环等进行鉴定。

1.2.2 分子鉴定 采用CTAB 法提取DNA，随后用两对引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），LR0R（5'-ACCCGCTGAACTTAAGC-3'）和LR5（5'-ACCCGCTGAACTTAAGC-3'），进行PCR扩增，反应体系：总体系为25 μL，分别为GO Taq green master mix (2×) 13 μL；ITS1 和ITS4 或LR0R和LR5 (10 pmol/L) 各1 μL；DNA 模 板1 μl；Nucleasr-free water 9 μL。反应条件：预变性94 ℃5 min；变性94 ℃ 1 min，退火50 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，共35 个循环；补平72 ℃ 10 min，10 ℃ 30 min。扩增完成后4 ℃保存并进行电泳检测，PCR 产物送生物公司进行测序。所得序列于GenBank 数据库进行BLAST 比对，下载相关序列并用Clustal X 软件进行对比，并用MEGA 6.06 中的Maximum Likelihood 法构建系统发育树。

1.2.3 香菇生物学特性对比分析（1）菌种活化。取保藏菌种接入斜面PDA 培养基，于25 ℃下培养，待菌丝长好后再转接到PDA 平板中心位置，25 ℃下培养，菌丝长满皿后备用。

（2）菌丝观察测定。长满菌丝的PDA 平板，用直径0.5 cm 的打孔器打孔取菌饼，接种到基础培养基平板中央，每个菌株3 次重复，培养3 d后开始进行观察和测定。每个菌株取3 个平板，以接种中心点为起点，测量菌落半径，计算平均值。长势以菌落圆整程度、菌丝浓密程度以及菌丝洁白程度来表示。

菌丝生长速度（mm/d)=［(平均菌落半径-5 mm)/2］/生长天数

（3）温度对菌丝生长的影响。用直径0.5 cm的打孔器打取菌饼，接入无菌PDA 培养皿中央，每个菌株3 个重复，分别放入15、20、25、30 ℃培养箱中培养，记录菌丝萌发、生长时间及满皿天数。

（4）碳源对菌丝生长的影响。以基础培养基作对照，将基础培养基中的葡萄糖分别换成麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉等，观察不同碳源对菌丝生长速度及长势的影响。

（5）氮源对菌丝生长的影响。以基础培养基作对照，将基础培养中的蛋白胨分别换成尿素、牛肉膏、酵母膏、硝酸钾等，观察不同氮源对菌丝生长速度及长势的影响。

（6）C/N 对菌丝生长的影响。将基础培养基中葡萄糖用量固定为20 g，改变蛋白胨的用量，配制7 个培养基处理，使葡萄糖与蛋白胨比例依次为10/1、20/1、30/1、40/1、50/1、60/1、70/1。观察不同C/N 对菌丝生长速度及长势的影响。

1.2.4 数据处理 试验数据分析采用SPSS 20.0 软件，应用邓肯氏新复极差法（Duncan）进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 野生香菇菌株的形态鉴定

林香18 野生子实体见图1 A。子实体稍小，菌盖直径为3.0～3.5 cm，最大可达4.0 cm，扁平球形至稍平展，表面浅褐色，光滑无鳞片，无毛状物；厚度1.1～1.5 cm，菌肉白色，细密；菌褶白色，弯生，不等长；菌柄长4.5～4.8 cm，粗0.6～1.0 cm，中生，白色，直立；菌环以下无纤毛状鳞片，纤维质，内实，菌环易消失，白色。

图1 野生香菇子实体Fig.1 Fruiting bodies of wild Lentinula edodes

林香19 子实体见图1 B。子实体中等，菌盖直径为3.5～4.0 cm，最大可达4.5 cm，扁平球形至稍平展，表面深褐色、棕褐色，光滑无鳞片，无毛状物，厚度0.9～1.5 cm；菌肉白色，细密；菌褶白色，弯生，不等长；菌柄长4.8～5.3 cm，粗0.7～1.2 cm，中生至偏生，白色，常弯曲；菌环以下无纤毛状鳞片，纤维质，内实，菌环易消失。从形态学上可将野生食用菌初步鉴定为香菇属。

2.2 分子序列分析

香菇野生菌株经PCR 扩增、测序后获得的ITS 和LSU 序列，通过BLAST 在GenBank 数据库中进行相似性检索和比对，下载其他香菇序列进行对比，用MEGA 6.0 构建系统发育树（图2）。由图2 可知，野生菌株林香18、林香19 与MH868346LentinulaedodesCBS225.51 和AF356159LentinulalateritiaTMI 1633 聚集在一个分支上，且该分支的最大似然引导支持率高达100%，因此把这两个菌株鉴定为香菇Lentinula edodes。

图2 基于ITSLSU 和序列采用极大似然法构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree generated from maximum likelihood based on ITS and LSU sequences

2.3 香菇生物学特性对比分析

2.3.1 不同温度对香菇菌丝生长的影响 由表1 可知，8 株供试菌株在温度15～30 ℃下均能生长，但菌丝生长速度存在较大差异。15 ℃时，L12 和L26 的菌丝生长速度最快、表现出耐低温的特性，而L808 和林香19 生长最慢、对低温比较敏感；20 ℃时，菌丝生长速度居前3 位的分别为L26、林香18 和L12；25 ℃为6 株栽培菌株的最适生长温度，其中L808 的菌丝生长速度最快、达4.91 mm/d；而30 ℃下，野生菌株林香18 的菌丝生长速度最快，其次为L808 和林香19。综上，L808、林香18 和林香19 具有较强的耐高温特性，其他5 个菌株均不耐高温。

表1 不同温度对香菇菌丝生长速率的影响Table 1 Effect of different temperature on mycelial growth rate of Lentinula edodes (mm/d)

2.3.2 不同碳源对香菇菌丝生长的影响 从表2可以看出，当碳源为葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖时，香菇L26、申香60 和申香34 的菌丝生长速度无显著差异，但当碳源为乳糖时三者的菌丝生长速度较慢。香菇L12 在含葡萄糖培养基中菌丝生长速度最快、达4.17 mm/d，与其他碳源差异显著，而在含麦芽糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉培养基中，乳糖的利用效果最差；香菇L808在含蔗糖的培养基上菌丝生长速度最快、为4.03 mm/d，其次是可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖，乳糖最慢、菌丝生长速度仅2.42 mm/d；林香18 在不同碳源培养基上菌丝生长速度差异显著，以蔗糖利用效果最好、菌丝生长速度达3.43 mm/d，乳糖利用效果最差、菌丝生长速度仅2.19 mm/d；林香19 在所有碳源中，对可溶性淀粉的利用效果最好、菌丝生长速度最快、为3.75 mm/d，乳糖利用效果最差、菌丝生长速度最慢、仅3.18 mm/d；浦香08 在所有碳源中，以麦芽糖培养基上菌丝生长速度最快、约为乳糖的2 倍。

表2 不同碳源对香菇菌丝生长速率的影响Table 2 Effect of different carbon source on mycelial growth rate of Lentinula edodes (mm/d)

从表3 可以看出，不同碳源条件下，L26、L808、申香34、申香60、林香18 和林香19 的菌丝长势无显著差异，只有L12 和浦香08 的菌丝长势存在差异。在碳源为葡萄糖、乳糖和可溶性淀粉时，L12 菌落圆整、菌丝较浓密、洁白，且在乳糖培养基上菌丝最为浓密；在可溶性淀粉培养基上菌丝浓密但老化快，存活时间较短。浦香08 在乳糖和可溶性淀粉培养基上，菌丝极浓密，菌落圆整、洁白；在葡萄糖、蔗糖和麦芽糖培养基上菌丝较浓密，菌落圆整、浅白色。L26 在5种碳源培养基上菌丝长势均表现极浓密，除了乳糖以外，其他4 种碳源菌丝长势均为圆整、洁白。L808 菌丝生长速度快，菌丝老化速度也较快，菌丝长势无显著差异，均为稀疏、灰白色、菌落完整。申香34 菌丝长势均为浓密、菌落圆整，在葡萄糖、乳糖培养基上菌丝呈灰白色，在可溶性糖和蔗糖上菌丝颜色更为洁白。申香60 菌丝长势无显著差异，菌丝长势较浓密、菌落圆整、浅白色。相比其他菌株，林香18 在不同碳源培养基上的菌丝萌发及生长速度慢，但菌丝长势浓密、洁白、菌落圆整。林香19 菌丝长势均表现稀疏圆整、浅白色，在5 个碳源培养基上生长无显著差异。

表3 不同碳源对香菇菌丝长势的影响Table 3 Effect of different carbon source on mycelial growth density of Lentinula edodes

2.3.3 不同氮源对香菇菌丝生长速度的影响 由表4 可知，L26 在不同氮源培养基上生长速率的表现依次为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏＞硝酸钾＞尿素，在蛋白胨、牛肉膏、酵母膏上菌丝生长速度最快、达3.75 mm/d；L12 在不同氮源培养基上生长速率的表现依次为蛋白胨、牛肉膏＞酵母膏＞硝酸钾＞尿素，在蛋白胨、牛肉膏上菌丝生长速度最快、达4.17 mm/d；L808、林香18、林香19 和浦香08 在不同氮源培养基上生长速率的表现依次为牛肉膏＞酵母膏＞蛋白胨＞硝酸钾＞尿素，以上4 种菌株在牛肉膏培养基上利用效果相对最好，生长速度分别为4.17、3.34、3.74、4.14 mm/d；申香34 和申香60 在不同氮源培养基上生长速率的表现依次为牛肉膏、酵母膏＞蛋白胨＞硝酸钾＞尿素，两菌株对牛肉膏、酵母膏的利用效果较好，菌丝生长速度分别为3.75、3.8 mm/d。

表4 不同氮源对香菇菌丝生长速率的影响Table 4 Effect of different nitrogen source on mycelial growth rate of Lentinula edodes (mm/d)

总体来看，8 个菌株在尿素培养基上均无法生长，在牛肉膏培养基上生长速度最快，在硝酸钾培养基上菌丝生长速度最慢，L12 菌株菌丝生长速度最快，林香18 生长速度明显低于其他7 个菌株。

从表5 可以看出，8 个菌株在尿素培养基上均不能生长，在硝酸钾培养基上长势无明显差异，均表现为菌落较圆整，菌丝稀疏、浅白色。L26、L12、L808、申香34 和林香18 等5 个菌株在其他3 种氮源培养基上表现一致，菌丝均极为浓密、洁白，菌落圆整；申香60 在蛋白胨、牛肉膏、酵母膏培养基上菌丝长势较浓密，无明显差异；林香19 和浦香08 在5 种氮源培养基上表现一致，均在蛋白胨和牛肉膏上表现菌丝较浓密、洁白、菌落完整，在酵母膏上表现菌丝极浓密。综上，在酵母膏培养基上除申香60 外其他7 个菌株长势均为菌丝浓密、洁白、菌落圆整。

表5 不同氮源对香菇菌丝长势的影响Table 5 Effect of different nitrogen source on mycelial growth density of Lentinula edodes

2.3.4 不同C/N 对菌丝生长速度的影响 不同C/N 条件下，香菇菌丝生长表现出明显差异。由表6 可看出，香菇菌丝可以在7 个不同的C/N 培养基中生长，其生长情况各有不同。香菇L26 在C/N 为10/1、20/1、50/1、60/1、70/1 条件下菌丝生长速度相同，为3.75 mm/d；L12 在C/N 为30/1条件下，菌丝生长速度最快，为4.08 mm/d；L808在C/N 为50/1 时菌丝生长速度最快，为3.97 mm/d；申香34 在C/N 为30/1 时菌丝生长速度最快，为3.8 mm/d；申香60 在C/N 为10/1 和50/1 生长速度相对较快，为3.8 mm/d；林香18 在10/1 时菌丝生长最快，为3.7 mm/d，林香18 的总体生长速度低于其他7 个品种；林香19 在70/1-10/1 的C/N 条件下，菌丝生长范围在3.48～3.8 mm/d，10/1 时菌丝生长速度最快，50/1 速度最慢；浦香08 在C/N为40/1 时菌丝生长速度最快，为4.15 mm/d。

表6 不同碳氮比对香菇菌丝生长速率的影响Table 6 Effect of different carbon to nitrogen ratios on mycelial growth rate of Lentinula edodes (mm/d)

由表7 可知，在不同C/N 的7 个处理中，申香34、林香18 与林香19 无显著差异，申香34和林香18 菌丝极为浓密、洁白，菌落圆整，而林香19 菌丝较浓密、浅白色，菌落圆整；L808 在C/N 为30/1 时菌丝生长表现浓密洁白，菌落圆整，其他6 个处理菌丝生长表现稀疏，为浅白色，菌落圆整；L12 只在C/N 为70/1 时菌丝长势表现稀疏、灰白色、菌落圆整，其他处理中菌丝生长表现差异不大，表现为浓密、浅白色，菌落圆整；L26 在C/N 为10/1 时菌丝长势最好，菌丝洁白、极为浓密，菌落圆整，其他6 个处理菌丝较浓密、洁白、菌落圆整；浦香08 在C/N 为10/1 和30/1时菌丝极浓密、菌丝洁白、菌落圆整；申香60 在C/N 为20/1 和40/1 时菌丝稀疏、浅白色、菌落圆整，当C/N 为10/1、50/1、60/1、70/1 时菌丝均较浓密且洁白，菌落圆整，当C/N 为30/1 时菌丝极浓密、洁白、菌落圆整。综合看来，申香34、林香18、林香19 菌丝长势不受C/N 的影响，其他5 个菌株菌丝长势受C/N 的影响。

表7 不同碳氮比对香菇菌丝长势的影响Table 7 Effect of different carbon to nitrogen ratios on mycelial growth density of Lentinula edodes

3 讨论

本研究对采自广西大明山的2 份野生食用菌标本进行形态特征观察和分子序列分析，发现从野生标本分离的菌株林香18 和林香19 与香菇Lentinulaedodes相似度最高，在ITS 构建的系统发育树上聚集在一起，因此将其鉴定为香菇Lentinulaedodes。两份材料的子实体外观形态差异不大，区别为林香18 菌盖颜色为浅褐色，而林香19 菌盖颜色为深褐色。广西野生香菇的研究报道较少，陈丽新［16］等曾对十万大山的野生香菇进行组织分离，认为分离部位不同，菌丝的生长速度和长势有差异。

野生菌的驯化栽培通常有赖于其菌种的生物学特性研究。本研究以香菇的2 株野生菌株和6 株栽培菌株为试材，测定不同温度、氮源、氮源、C/N 对菌丝生长的影响，结果显示，供试的8 株香菇菌丝在15～30 ℃条件下均可以生长，生长速度具有一定规律，多数菌株的菌丝生长速度在15～25 ℃呈上升趋势，25～30 ℃菌丝生长速度缓慢，6 株栽培菌株生长的最适合温度均为25 ℃，而2 株野生菌株在30℃时的菌丝生长速率最高。同时得出供试8 个菌株菌丝生长的最适营养条件，其中L26 最适碳源为葡萄糖，最适氮源为蛋白胨、牛肉膏或酵母膏，在7 种不同C/N 中无显著差别；L12 最适碳源为葡萄糖，最适氮源是蛋白胨或牛肉膏，最佳C/N 是30/1；L808 最适碳源为蔗糖，最适氮源为牛肉膏，最适C/N 为50/1；申香34 最适碳源为可溶性淀粉，最适氮源为酵母膏或牛肉膏，最适C/N 为30/1；申香60 最适碳源是可溶性淀粉、麦芽糖或蔗糖，最适氮源为酵母膏或牛肉膏，最适C/N 为10/1、50/1；林香18 最适碳源是蔗糖，最适氮源为牛肉膏，最适C/N 为10/1；林香19 最适碳源是可溶性淀粉，最适氮源为牛肉膏，最适C/N 为10/1；浦香08 最适碳源为麦芽糖，最适氮源为牛肉膏，最适C/N 为40/1。本研究结果与已往的文献报道相似，如袁思明等［12］对野生香菇菌丝最佳生长条件进行研究，菌丝在牛肉膏上生长最好。熊雪等［13］指出，野生马桑香菇菌丝的最优碳源为蔗糖，最优氮源为蛋白胨，培养温度以23～25 ℃最优。方志荣等［14］认为，香菇属的最佳碳源为玉米粉，最佳氮源为酵母膏，最适培养温度为25 ℃；伍燕等［17］研究发现，香菇菌丝在葡萄糖培养基上生长更好，而在尿素上不能生长。推测多数食用菌菌丝均无法直接利用尿素，可能是因为尿素在高压灭菌时发生了缩合反应，生成的缩二脲、缩三脲等无法被菌丝吸收利用，导致菌丝无法生长。曾茜等［18］发现，野生香菇黔香筛5 号母种培养基的最佳碳氮源为葡萄糖和硫酸铵，最适培养温度 25～30 ℃。廖真等［19］研究表明，野生香菇菌丝生长的最适碳源为果糖，最适氮源为牛肉膏，最适生长温度25 ℃，而在尿素培养基上菌丝无法生长。本研究结果野生香菇林香18 和林香19 菌丝生长的最适氮源是牛肉膏，这与袁思明等［12］、廖真等［19］的研究结果一致。由此推测在蛋白胨和牛肉膏为氮源的处理下，菌丝长势较好，可能是因为这种复合氮源中营养较为丰富，能够满足菌丝生长的营养需求。温度方面，本研究试材野生香菇林香18、林香19 与曾茜等［18］研究的“野生香菇黔香筛5 号”均为耐高温野生香菇，与熊雪等［13］研究的野生马桑香菇、方志荣等［14］研究的野生微香菇属 (Lentinula)真菌存在差异。

本研究中，8 株香菇在7 种不同C/N 培养基上的菌丝生长速度没有任何规律，但多数菌株在C/N 为10/1 时菌丝生长速度最快，而张权［20］研究发现5 种香菇（931-9，灵仙一号，南山一号，9608，L808）的最适C/N 为20/1，由此推测不同品种的香菇在碳源、氮源需求上差异较小，但在C/N 需求上存在较大差异，同一菌种不同菌株之间利用碳氮的能力也有所不同。

4 结论

本研究通过形态学和分子学相结合的方法，将来自广西上林县大明山的两份野生食用菌鉴定为香菇。通过与6 个主要栽培菌株进行生物学特性的比较分析，结果表明，两株野生菌株在30 ℃条件下的菌丝生长速度均高于25 ℃，表现出较强的耐高温特性，说明野生菌株为耐高温菌株，其他菌株为中温性品种，生长最适合温度在25 ℃。本试验筛选出适宜当地高温气候条件的香菇种质资源为林香18 和林香19，为野生香菇种质资源的应用，特别是耐高温香菇新品种的选育提供了新材料及重要参考依据。