红掌小滴玻璃化法超低温保存研究

高洁　李志英　张玄兵　谢龙海　陈莹　朱振芬　符运柳　徐立

关键词：红掌；小滴玻璃化法；超低温保存；腋芽；遗传稳定性

中图分类号：S682.14 文献标识码：A

红掌（Anthurium andraeanum Lind.）为天南星科（Araceae）多年生常绿草本植物，其花色多样，佛焰苞独特，插花效果大胆新颖，切花保存时间长质量优，是第二大热带花卉，也是世界销量最大的“贵族”花卉之一。作为国际上重要的切花和盆栽观赏植物，红掌在花卉产业中占有重要地位，在全球花卉贸易中，为世界五大设施花卉之一。在我国，2019 年红掌的销量为3500 万盆[1]。目前，红掌在各个国家及地区都有商业栽培，品种日益增加，通过种间杂交已培育出大量栽培品种，2000 年已培育出红掌优良栽培品种600 余个[2-3]。获得基因库中可用的遗传资源是红掌育种遗传改良成功的关键因素，但在新品种的推广过程中，大多数传统品种逐渐丢失。因此，种质资源的保存对于红掌生产及新品种的选育显得极为重要。红掌种质资源保存方法以建立田间资源圃和试管苗保存种质等传统保存方法为主。种质圃保存耗时费力，占用大量土地资源，且在保存过程中易受病害侵扰。而试管苗保存对温度、光照和低湿等环境条件要求严格，导致保存能耗较高，需定期继代，且易发生变异，影响种质资源的保存效果。

目前，超低温保存被认为是长期有效保存多种形式的植物种质的首选方法，是不同于传统的种质资源田间与试管苗保存的一种替代方法，可在几十年内以较小的空间和较低的日常维护，在一个相对安全的条件下最大化地长期保护植物的遗传资源[4-5]。随着对超低温保存研究的不断深入，发展出了许多冷冻方法，如两步冷冻法、干燥冰冻法、玻璃化法、包埋-脱水法、包埋-玻璃化法、小滴玻璃化法等。小滴玻璃化法在吸取玻璃化法的主要优点后，对冷冻及化冻程序进行了改良，在冷冻过程中将植物材料直接与玻璃化液、装载液及液氮接触，因此能实现较快的冷却或复温速率，减少在冷却和复温过程中细胞内冰晶的形成，同时铝箔是一种良好的热传导材料，热量传导快速且均匀[6]，提高了冷冻和化冻的速率，从而极大提高了超低温保存植物种质资源后的再生率[7]。小滴玻璃化法是目前应用最广泛的基因库超低温保存植物种质的冷冻方法[8]，采用小滴玻璃化法已成功保存了菠萝[9]、香蕉[7]、甘蔗[10]等热带草本植物。

尽管超低温保存已是许多重要的经济植物的常规保存方法，但不同种类植物、同种植物的不同资源对超低温处理的反应均不同，需要针对每份资源开展研究。鉴于红掌超低温保存研究还较少，本研究通过小滴玻璃化法超低温保存技术，在常规保存方法的基础上对红掌的小滴玻璃化超低温保存条件进行比较研究，筛选出适宜的保存条件，以期建立一种操作简便并能长期稳定保存红掌种质资源的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

以 中 国 热 带 作物中期库提供的红掌PinkChampion（PC）无菌苗约200 瓶為材料，组培苗在继代培养基1/2MS+0.2 mg/L BA+0.2 mg/LNAA+30 g/L 蔗糖+6.5 g/L 卡拉胶（pH 5.8，高温灭菌）上生长2～3 个月。

1.2 方法

1.2.1 超低温保存（1）预处理。切取1～2 mm 带腋芽的茎段置于带滤纸的预培养基（MS+0.4 mol/L蔗糖+2 mol/L Gly +6.5 g/L 卡拉胶，pH 5.8，高温灭菌）上培养1～5 d。

（2）PVS2 脱水。预培养后，将材料转入0 ℃的30%、60%、80%的PVS 溶液中，分别处理10、40、50、60、100 min，30%、60%、80%的PVS溶液分别由0.4 mol/L 蔗糖MS 溶液与3.26 mol/L甘油（7∶3， V/V）溶液、2.42 mol/L 乙二醇（4∶6，V/V）溶液和1.9 mol/L 二甲基亚砜（2∶8， V/V）溶液配置而成。

（3）液氮冷冻。在PVS2 处理结束前2 min 用无菌滴管将20 个材料转到铝箔条上，并加15 μL PVS液滴，整个过程保持在0 ℃环境下完成；用无菌镊子将铝箔条迅速浸入液氮（–196 ℃）中2 s 后快速转入装满液氮的2 mL 冻存管中，关盖后液氮中至少保持30 min；每个处理15 个材料转移至液氮中，另外5 个直接转移到RS（卸载处理溶液）中（对照），每个处理重复3 次。

（4）复温卸载。复温时将铝箔迅速从液氮中取出，放入室温下的RS（卸载液：MS+1.2 mol/L蔗糖，pH 5.8，过滤灭菌）中浸泡几秒后，液滴脱离，取出铝箔片材料游离到卸载液中继续保持15～20 min。

（5）用镊子将上述复温卸载后的材料置于无菌滤纸上，除去卸载液后，置于放置2 层无菌滤纸的半固体培养基（MS+0.3 mol/L 蔗糖）上，在25 ℃黑暗培养箱中培养2 d。

（6）再生2 d 后，将组织转到无滤纸的再生培养基（ 1/2MS+0.8 mg/L BA+0.2 mg/L 2，4-D+30 g/L 蔗糖+6.5 g/L 卡拉胶，pH 5.8，高温灭菌）上，促进材料分化愈伤组织，黑暗培养1 周后转入光照条件，并转入继代培养基中，4 周后统计存活率。

1.2.2 DNA 提取和检测根据改良的CTAB 法，提取红掌小滴玻璃化法超低温保存后的再生植株和未经处理植株的DNA，通过SimpliNano 微量分光光度计检测纯度及浓度，达到SSR 和ISSR要求后，–20 ℃保存备用。

1.2.3 ISSR 分析利用 8 条UBC 通用引物进行PCR 扩增。反应体系：12.5 μL Taq Master Mix，1.0 μL 模板，1.0 μL 引物，10.5 μL 无菌水。PCR程序设置为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，退火（温度根据引物说明设置）15 s，72 ℃延伸2 min（循环35 次），72 ℃延伸10 min。

1.2.4 SSR 分析利用 6 对已发表的红掌SSR 引物进行PCR 扩增（表1）。SSR 引物由广州天一辉远生物科技有限公司合成。反应体系：12.5 μLTaq Master Mix，1.0 μL DNA，1.0 μL 正向引物，1.0 μL 反向引物，9.5 μL 无菌水。PCR 程序设置为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，退火（温度根据引物说明设置）15 s，72 ℃延伸1 min（循环33 次），72 ℃延伸10 min。

2 结果与分析

2.1 红掌腋芽小滴玻璃化法超低温保存正交试验

2.1.1 正交试验结果由正交试验结果可以看出（表2），在影响红掌PC 腋芽超低温保存存活率的因素中，PVS 浓度极显著影响红掌PC 腋芽超低温保存的存活率，预培养时间顯著影响红掌PC腋芽超低温保存的存活率，PVS 处理时间也影响其存活率。在9 个处理方案中，处理6（ABC：预培养时间4 d、PVS 浓度80%和PVS处理时间40 min）的超低温保存存活率最高，达61.48%。对比红掌Amigo 胚性悬浮细胞超低温保存32.1%的存活率[11]，有明显提升。由表2 可知，红掌PC腋芽超低温保存过程中，预培养时间、PVS 浓度和PVS 处理时间3 个因素的最佳水平分别是4 d、80%和50 min（ABC），但此最佳水平组合并未在本试验中体现，对此结果仍需进一步验证。

2.1.2 单因素试验结果正交试验得出最佳处理组合后，还需开展不同单因素对红掌腋芽小滴玻璃化法超低温保存存活率的影响。只变化单因素，其他处理按最佳水平即预处理4 d、PVS 浓度为80%和装载50 min 进行。如图1A 所示，预培养与未经预培养的存活率有明显差异。随着预培养时间的延长，红掌PC 腋芽存活率呈先上升后下降的趋势。预培养4 d 的存活率最高，达60%，高于其他处理。预培养时间延长，红掌细胞含水量逐渐减少，当预培养5 d 以后细胞产生了渗透胁迫，使部分细胞失去活性，降低存活率。

红掌 PC 腋芽小滴玻璃化法超低温保存后的存活率对PVS 装载液浓度的变化比较敏感（图1B）。随着PVS 装载液浓度的增加，红掌PC 超低温保存的存活率先逐渐增加后下降。当PVS装载液浓度为80%时，存活率最高，达61.48%。PVS 装载液浓度对红掌PC 超低温保存的存活率）的影响比较明显，而PVS 装载液浓度过高后存活率反而下降。未经PVS 装载的红掌材料没有存活，可能是红掌材料易受装载液的毒害影响，但若不经过装载液保护红掌材料则不能承受低温冻害。

本研究发现，随着PVS装载液处理时间的延长，红掌PC 腋芽超低温保存的存活率增加，但超过50 min 后，红掌腋芽由于受PVS 的毒害，存活率反而下降。PVS 装载液处理50 min 时，红掌腋芽存活率最高，达63.70%（图1C）。

综上，正交试验所得的最佳处理组合能使红掌PC 腋芽小滴玻璃化法超低温保存的存活率达到最优。

2.2 红掌 PC 小滴玻璃化法超低温保存的遗传稳定性检测

2.2.1 DNA 的提取提取红掌PC 对照植株和再生植株的DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳的检测结果如图 2 所示，为单一条带，无降解现象，纯度较高，满足2 种标记试验需求。

2.2.2 ISSR 电泳检测结果 8 条ISSR 引物扩增后，最多的能扩增出11 条清晰的条带（UBC 807），最少的能扩增出3 条条带（UBC840），8 条引物共扩增出56 条条带（表3）。图3 所示为其中的6 条引物扩增电泳图，红掌PC 对照和小滴玻璃化法超低温保存再生植株条带均一且无杂带，初步证明红掌腋芽小滴玻璃化法超低温保存不会影响材料的遗传稳定性。

2.2.3 SSR 电泳检测结果利用已发表的6 对SSR 引物进行后续SSR 分析，结果表明，小滴玻璃化法超低温保存后的红掌样品与保存前的样品未出现差异性条带（图4），再次证明了红掌腋芽小滴玻璃化法超低温保存的再生植株未发生遗传变异。因此，结合ISSR 电泳结果基本可以确定小滴玻璃化法超低温保存不会改变红掌PC 材料的遗传稳定性。

2.3 红掌腋芽小滴玻璃化法超低温保存后的增殖情况

红掌腋芽小滴玻璃化法超低温保存4～6 周后，材料会出现各种不同变化：材料长出愈伤组织（图5A），有些材料褐变死亡（图5B）；无愈伤组织再生直接长出腋芽（图5C）；材料逐渐长出腋芽和愈伤组织（图5D）；超低温保存5 个月后长出的再生植株（图5E）。

3 讨论

植物遗传资源是农业生产最重要的自然资源[12]，是物种进化、植物育种和遗传学研究的物质基础。随着植物遗传多样性和遗传资源潜在价值的急剧减少，植物种质资源保存成为一个全球共同关注的课题[13]。自HENSHAW 和MOREL 首次提出离体保存植物种质资源后[14]，许多不能常规保存的植物得以保存。而在离体保存中超低温保存是目前唯一能长期保存物种的有效的理想手段[13]。植物种质资源越来越多地使用超低温保存技术，以确保无性繁殖植物资源的安全[15]。

在自然界中，许多植物在承受环境压力下能够形成保护机制，在冷冻保存程序之前加入预处理这一步骤，特别是一些对直接置于玻璃化液中十分敏感的热带植物，更有利于超低温保存后植物材料的存活。预培养促使材料初步脱水减少细胞中的自由水含量，提高细胞脱水耐受性和渗透压，减少超低温保存过程中冰晶的产生和装载过程中PVS 溶液的毒害。细胞溶液在超低温保存过程中向玻璃化状态的转化是影响生物材料冷冻存活的重要因素[16]，置于液氮中的时间则不影响材料的存活率。在高山红景天超低温保存过程中，用1 mmol/L 蔗糖MS 预培养基效果最好[17]。从马铃薯小滴玻璃化法超低温保存的研究中得出，预培养中用0.3、0.5 mmol/L 蔗糖的MS 液体培养基对马铃薯茎尖进行梯度脱水1 d 后，茎尖的存活率和再生率最高[18]。罗汉果茎尖小滴玻璃化法超低温保存使用含0.7 mmol/L 蔗糖的MS 培养基预处理1 d 效果更佳[19]。本研究结果表明，红掌腋芽小滴玻璃化法超低温保存需要进行预培养，使用含0.4 mmol/L 蔗糖和2 mmol/L 甘油的MS 固体培养基培养4 d，红掌PC 腋芽的存活率最高。培养时间延长后，腋芽的存活率反而下降，这可能与红掌对高浓度蔗糖和甘油的耐性有关。

不同的低温保存方法在技术细节上有所不同。然而，大多数都需要使用化学物质保护——低温保护剂。低温保护剂相互作用，改变细胞内外的水分布，使细胞脱水[20]。这些物质增加了质膜的稳定性或完整性，降低了冰点，增加了细胞质的黏度，同时在整个冷冻过程中保护细胞不受伤害，是保证植物超低温保存材料存活的关键。一般将不穿透细胞的低温保护剂（蔗糖和其他碳水化合物）和穿透细胞的低温保护剂（二甲基亚砜、乙二醇、甘油等）以不同比例组成PVS、PVS、PVS 等溶液[21]。PVS 中的二甲基亚砜是常用的渗透剂，但其毒性是完全发挥低温保护潜力的根本障礙[22]。因此，在超低温保存过程中，确定所使用的低温保护剂的最佳浓度和暴露时间是至关重要的。本研究采用80% PVS 装载液在0 ℃装载50 min，效果最好。而月季茎尖的超低温保存以60% PVS 装载30 min 存活率最高[23]，罗汉果小滴玻璃化法的最佳处理是60%装载液于25 ℃处理30 min[19]。

尽管近年来植物种质资源超低温保存研究取得了显著进展，但对于不耐低温和脱水敏感的热带植物的超低温保存研究还较少，目前报道的超低温保存热带植物的种类少，存活率极低[24-26]，还有大量热带作物的超低温保存技术尚未开展研究。以无性繁殖植物为主的热带植物，对超低温保存技术的需求日益增加。国外关于红掌的组织培养始于20 世纪70 年代末，国内兴起较晚，始于20 世纪90 年代，近几年关于红掌组织培养的报道越来越多[27]。本研究探索红掌超低温保存小滴玻璃化法的处理程序，结果表明，红掌PC 腋芽放于含0.4 mmol/L 蔗糖和2 mmol/L 甘油的MS固体培养基中预培养4 d 后，在0 ℃下80% PVS溶液中装载50 min，然后转到铝箔条上PVS 液滴中，将铝箔条迅速浸入液氮中2 s 后直接转入装满液氮的冻存管中，投入液氮至少保持30 min；室温下用含有1.2 mmol/L 蔗糖的MS 液体培养基复温，并卸载20 min 后置于恢复培养基上，腋芽存活率高且遗传稳定性好。本研究结果为建立红掌小玻璃化超低温保存体系奠定基础，为红掌种质资源研究提供参考，对红掌超低温种质资源基因库的建立和其他热带草本植物的超低温保存具有重要的理论和实践意义。