基于HS-SPME-GC-MS分析墨兰不同花器官香气成分

丁丽琼　罗清　覃茜　唐毓玮　吕丽兰　池昭锦

关键词：墨兰；花器官；香气；HS-SPME-GC-MS

中图分类号：S682.31 文献标识码：A

墨兰（ Cymbidium sinense ） 为兰科（Orchidaceae）兰属（Cymbidium Sw.）的地生植物，因其叶形优美、品种丰富、花期恰逢春节而深受消费者欢迎[1]。墨兰为国兰代表性种类之一，其花香馥郁、沁人心脾[2]，为优质香料物质，具有很高的经济价值和观赏价值[3]。香气是构成和影响花卉观赏价值的重要因素，但由于花香的成分、结构及其生物合成过程比较复杂，研究水平滞后于花形、花色等其他观赏性状的研究[4]。近年来由于分析技术的进步，对兰科植物香气研究逐渐增多。BAEK 等[5]采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME-GC-MS）对大花蕙兰新杂交种阳光之钟盛花期花器官挥发物进行了测定，鉴定出23 种成分，其中柱中鉴定出12种化合物，唇瓣中鉴定出16 种化合物，萼片中鉴定出11 种化合物，花瓣中鉴定出9 种化合物。王元成等[6]采用HS-SPME 结合GC-MS 技术，对5种石斛花朵的挥发性成分进行分析，共鉴定出110个挥发性成分，主要成分为烷类、烯类、醇类、酮类等，且不同石斛花朵的芳香成分不尽相同。晋宇轩等[7]采用SPMG 结合GC-MS 技术对贵州春兰的花苞和花朵进行检测，结果检测出挥发性成分分别为43 种和47 种，花苞中烃类含量最高，花朵中萜烯类的含量最高，橙花叔醇為主要花香成分。杨慧君等[8]采用SPME-GC-MS 联用技术分析小桃红花香成分，共鉴定出挥发性成分35 种，酯类物质含量最多，主要花香成分为茉莉酸甲酯、茉莉酮酸甲酯和金合欢醇。许红娟等[9]采用顶空固相萃取法结合气相色谱和质谱对蕙兰守良梅花朵各部位（蕊柱、唇瓣、棒瓣、主瓣和副瓣）进行香气成分检测，结果发现蕙兰守良梅花朵蕊柱的主要香气成分有7 类23 种，花朵5 个部位的醇类芳香物质相对含量较高。魏丹等[10] 采用HS-SPME-GC-MS 联用分析3 种兰花鲜花的香气成分，结果发现蕙兰鲜花的主要花香成分为桉油精、（E）-4-己基葵烯-6-炔等，墨兰鲜花的主要花香成分为甲基-异丁子香酚、6-氧代庚酸甲酯等，春兰鲜花的主要花香成分为α-芹子烯、十二烷等。目前未见墨兰不同花器官的挥发性物质成分的相关研究报道。鉴于此，本研究以墨兰为材料，基于HS-SPME-GC-MS 技术探索墨兰不同花器官的花香成分的差异，以期为培育香型兰花新品种奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用的材料为广西亚热带作物研究所兰花种质资源圃培育多年生的墨兰植株。在1 月份晴天10：00—11：00 选取开放第4 天盛花期的墨兰花朵（图1），取萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱4个部分各1 g（重复3 次），用于香气成分测定，使用顶空固相微萃取方法萃取样品中的香气成分。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理 将新鲜花朵的不同器官样品加一级水混匀至50 mL 离心管中，分别取5 mL待测样品、1.00 g 氯化钠和10 μL 内标（4-甲基-2-戊醇，1.0018 g/L）置于20 mL 样品瓶中，迅速用带有聚四氟乙烯隔垫的盖子拧紧，移至加热和搅拌装置中，在40 ℃下加热搅拌30 min，搅拌速度为500 r/min。

1.2.2 顶空固相微萃取（HS-SPME） 使用SPME萃取头（50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS， Supelco，Bellefonte， PA.， USA）与CTC CombiPAL 自动进样器（CTC Analytics， Zwingen， Switzerland）相连进行自动化的顶空固相微萃取。经过前处理的萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱分别取1 g 放入萃取瓶中，萼片、花瓣及唇瓣分别置于1 L 的萃取瓶中，蕊柱分别置于60 mL 萃取瓶中，50 ℃平衡10 min后，将已活化SPME 萃取头插入萃取瓶的顶空部分，萃取30 min。之后取出SPME 萃取头，立即插入GC 进样口在250 ℃条件下解析8 min。

1.2.3 气相色谱质谱联用仪（GC-MS）条件 采用Agilent 6890 气相色谱仪与Agilent 5975 质谱仪相连，色谱柱采用HP-Innowax 毛细管柱（60 m×0.25 mm ×0.25 μm，J&W Scientific，Folsom，CA）分离鉴定芳香挥发物。

气相色谱条件：载气（He）流速为1 mL/min；采用不分流模式自动进样，升温程序为50 ℃保持1 min，然后以3 ℃/min 升温至220 ℃，保持5 min。

质谱条件：质谱接口温度为280 ℃，离子源温度为230 ℃，电离方式为EI，电离能为70 ev，质谱扫描范围为m/z 29-350。

1.2.4 香气物质定性与定量分析方法 （1）定性分析。利用自动化质谱图解卷积和鉴定软件（AMDIS）计算保留指数（retention index， RI）和质谱图信息。其中，有标准品的目标组分，与标准品的出峰时间和质谱谱图比较定性；没有标准品的目标组分，通过保留指数与NIST11 标准谱库的RI 和质谱谱图比对进行定性分析。化合物的保留指数是通过分析相同色谱条件下C6-C24正烷烃保留指数计算得到。具体公式如下：

式中，I 为保留指数，t，t，t分别代表组分及碳数为n，n+1 正构烷烃的保留时间。

（2）定量分析。配置1 L 含7 g/L 酒石酸和200 g/L 模拟水溶液，并用NaOH 调pH 至3.4。将溶解在乙醇（色谱级）的所有标准品溶液混合，并将混合液用模拟水溶液稀释成连续的15 个浓度水平。在与样品相同的条件下，提取并分析每个浓度水平的香气标准曲线。通过建立香气物质标准曲线（横坐标：香气化合物标准品与内标4-甲基-2-戊醇的峰面积比，纵坐标：该香气化合物标样的浓度），对相关香气化合物进行定量分析。除此之外，其他没有标准曲线的化合物通过相似结构的化合物或者碳原子数相似的化合物的标准曲线进行定量分析[11]。相对含量为组分峰面积占总峰面积的百分比[12]。

1.3 数据处理

各组分质谱经计算机谱库检索及资料分析并结合人工谱图解析，确认各个化学成分。使用Origin 8.0 软件对数据进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 墨兰不同花器官挥发化合物组成

经过GC-MC 分析，从墨兰盛花期的花朵中检测出7 类共54 种挥发性成分，主要由21 种醛类、12 种醇类、10 种酮类、5 种苯类、2 种呋喃类、2种酸类和2 种萜类化合物组成，其中醛类含量最高（图2）。在不同器官中各种主要成分的含量不同，在萼片中醇类较其他3 个器官少，而酸类则较其他器官多1 种，花瓣及唇瓣中醛类较其他器官少1种，萼片及唇瓣中酮类较其他器官少。

在不同花器官中，墨兰花的萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱检测出的香气成分分别有49、51、48 和51 种。蕊柱及花瓣香气的组成成分最多，其次是萼片，唇瓣较少。不同花器官挥发成分见表1。由图3 可知，4 种组织均含有的化合物有48 种，包括19 种醛类（苯甲醛、2，4，-二甲基苯甲醛、丙醛、异戊醛、戊醛、巴豆醛、己醛、E-2-戊烯醛、庚醛、青叶醛、环戊基甲醛、（Z）-4-庚烯醛、E-2-庚烯醛、壬醛、（E，E）-2，4-己二烯醛 、E-2-辛烯醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、鸢尾醛、2，4-辛二烯醛）；10 种醇类（甲醇、1-戊烯-3-醇、E-2-戊烯-1-醇、1-己醇、Z-3-己烯醇、蘑菇醇、2-丙基-1-戊醇、2-乙基己醇、E-2-辛烯醇、苯甲醇）；9 种酮类（甲基异丁酮、1-戊烯-3-酮、2-庚酮、环己酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、3，5-辛二烯-2-酮、2，2，6-三甲基环己酮、（E，E）-3，5-辛二烯-2-酮、异佛尔酮）；5 种苯类（甲苯、对乙基甲苯、1-乙基-2，4-二乙基苯、M-异丙基甲苯、1-溴萘）；2 种萜类（茶螺烷、2，4-二叔丁基苯酚）；2 种呋喃類（2-乙基呋喃、2-戊基呋喃）；1 种酸类为己酸。花瓣、萼片及蕊柱共有成分3 种（2，3-戊二酮、桉叶油醇、丙炔醇）。只在萼片中检测到有2 种（2-甲基-4-戊醛和戊酸），丙烯醛只在蕊柱检测出。

萼片中检测出的香气成分数量中等但物质含量最高，达99 106.15 μg/L，占总挥发性有机成分的35.88%。花瓣及蕊柱检测出的香气成分数量比萼片多2 种，物质含量分别为56 571.48、78 868.68μg/L， 分别占总挥发性有机成分的20.48%和28.56%。唇瓣中检测出的香气成分数量最少，物质含量也最少，为41 645.32 μg/L，占总挥发性有机成分的15.08%。因此，墨兰不同花器官香气成分及其含量存在差异，萼片挥发性物质含量最高与感官上的初步判断一致。

在准确定量的化合物中，醛类化合物含量最高，为239 760.71 μg/L；其次是醇类化合物为34 864.05 μg/L，苯类化合物为940.50 μg/L，酸类化合物为456.53 μg/L，酮类化合物为122.91 μg/L，萜类化合物为47.01 μg/L ， 最少的呋喃类为0.15 μg/L。检测到醛类化合物中含量最高的是环戊基甲醛；醇类化合物中含量最高的是1-戊烯-3-醇；苯类化合物中含量最高的是2，4，-二甲基苯甲醛；酸类化合物中含量最高的是己酸；酮类化合物中含量较高的是甲基庚烯酮；萜类化合物中含量最高的是2，4-二叔丁基苯酚；呋喃类化合物中含量较高的是2-戊基呋喃。

2.2 墨兰不同花器间香气成分挥发量的差异

各化合物挥发量在不同器官中存在着明显差异，且每个器官化合物含量不同（表2）。萼片中有11 种化合物含量均较其他3 个器官含量高，其中环戊基甲醛在萼片中含量最高，为41 248.26 μg/L，其次是花瓣为17 659.45 μg/L，唇瓣及蕊柱含量远低于萼片，分别比萼片少35 053.29、33 941.80 μg/L，具有薄荷的樟脑味。1-戊烯-3-醇在花瓣中含量最高（4170.67 μg/L），具有水果香味。唇瓣中丙醛、1- 戊烯-3- 酮、E-2- 戊烯醛、E-2- 戊烯-1- 醇、（E，E）-3，5-辛二烯-2-酮等5 种化合物含量均较其他3 个器官含量高，具有水果清香味。蕊柱中有18种化合物含量均较其他3 个器官含量高，其中E-2-庚烯醛在蕊柱中含量高达1 174.91 μg/L，其次是唇瓣552.74 μg/L，在萼片及花瓣中的含量为191.59、160.43 μg/L，具有青草香和油脂香。

2.3 不同花器官挥发物主成分分析

为了进一步反应墨兰不同花器官香气物质构成的差异，对4 个不同花器官的54 个挥发性物质进行主成分分析。对于不同花器官与挥发性成分之间（图4），第一主成分（PC1）的贡献率为61.8%，第二主成分（PC2）的贡献率为25.8%，前2 个主成分占总方差的87.6%，能够很好的保留样本原来的信息。4 种花器官中唇瓣和花瓣位于同一象限，表明差异性小。蕊柱单独在PC1、PC2 负方向上，说明与其他器官差异性大。萼片单独在PC1正方向、PC2 负方向上，也与其他器官差异性大。戊醛（4）、己醛（6）、E-2-戊烯醛（7）、E-2-己烯醛（10）、环戊基甲醛（11）、E-2-庚烯醛（13）、1-戊烯-3-醇（23）、E-2-戊烯-1-醇（25）在PC1和 PC2 上的贡献较高，说明这些成分是花器官香气释放的主要挥发性成分。1-戊烯-3-醇（23）在 PC1 的正方向上贡献最大，与花瓣呈正相关关系，且在花瓣中含量最高。己醛（6）在PC2的负方向上贡献最大，与蕊柱呈正相关关系，且在蕊柱中含量最高。

3 讨论

花香是植物的重要特征[36]，挥发性化合物的数量和类型是影响花香品质的重要指标，也决定了兰花的商业价值。我国传统的观赏兰花包括春兰、蕙兰、建兰、墨兰、寒兰和莲瓣兰等系列，不同系列不同品种的兰花香气成分种类存在异同。不同品种蕙兰[37]香气成分主要为萜烯类、醇类、醛类、酯类、酮类、烷烃类和芳香烃，另有少量的酚类、酸类和醚类物质，建兰品种小桃红主要香气成分为酯类[8]，贵州春兰挥发性成分和花香成分的主要物质是萜烯类[7]，不同花色寒兰香气成分主要有醇类、醛类、酸类、萜烯类、酮类、烷类和酯类[38]。本研究中墨兰盛花期的花朵中检测出7 类共54 种挥发性成分，主要由醛类、苯类、醇类、呋喃类、酸类、萜类和酮类等化合物组成，其中醛类含量最高。

花朵不同花器官所含的挥发物及含量差异明显，不同品种花朵挥发性成分释放的主要花器官也不同。徐慧等[39]研究表明牡丹不同部位之间的挥发性化合物种类和相对含量存在较大差异，周晨晨等[40]研究表明白兰地海棠不同花器官的花香成分存在明显差异，挥发性成分释放的主要花器官是雌蕊。宋朝伟等[41]研究表明2 个芍药品种花香成分在不同花器官之间香气物质的释放量均呈现出明显差异，释放量最高的为瓣化雄蕊，与感官上香气的初步判断相吻合。本研究中，墨兰萼片共检测出49 种挥发物，物质含量最高，其中含量最高的挥发物为环戊基甲醛，具有薄荷的樟脑味；蕊柱检测出的挥发物物质含量次之，其含量最高的挥发物为己醛，呈青草香气；花瓣检测出挥发物的物质含量第三，其含量最高的挥发物为1-戊烯-3-醇，具有水果香味；唇瓣检测出挥发物的物质含量最低，其含量最高的挥发物为环戊基甲醛；萼片挥发性物质含量最高与感官上的初步判断一致，萼片是挥发性成分释放的主要花器官。通过主成分分析发现，4 种花器官中唇瓣和花瓣差异性小，蕊柱与其他器官差异性大，萼片也与其他器官差异性大。戊醛、己醛、E-2-戊烯醛、E-2-己烯醛、环戊基甲醛、E-2-庚烯醛、1-戊烯-3-醇、E-2-戊烯-1-醇是4 个花器官香气释放的主要挥发性成分，主要呈青草、水果香味。

本研究表明，不同花器官中挥发性香气成分种类组成相似，由醛类、苯类、醇类、呋喃类、酸类、萜类和酮类等化合物组成。但不同花器官挥发物物质含量不同，48 种共有物质在不同花器官中物质含量存在显著差异。萼片物质含量最高，因此盛花期墨兰花朵萼片是挥发性成分释放的主要花器官。不同花器官的花香成分物质含量存在明显差异，这为研究香型兰花新品种选育及香气形成机制提供参考依据。