感染黄龙病茶枝柑的症状表现及其病原在枝条与果实橘络中的分布规律

邓云双　李桃　邓晓玲　郑正

关键词：柑橘黄龙病；症状；茶枝柑；橘络；病原分布

中图分类号：S436.66 文献标识码：A

柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing， HLB）是世界柑橘生产中最具毁灭性的病害之一，对全球的柑橘产业造成巨大的经济损失。黄龙病病原为α- 变形菌纲（ Alphaproteobacteria ）， 根瘤菌科（Rhizobiaceae），候选韧皮部杆菌属细菌（Candidatusliberibacter spp.）[1]。根据病原16S rDNA 和β-操纵子基因的序列特征，以及传病媒介和病原性质，可分为亚洲种（Candidatus Liberibacterasiaticus， CLas）、非洲种（Candidatus Liberibacterafricanus， CLaf）和美洲种（Candidatus Liberibacteramericanus， CLam），其中CLas 的分布范围最广，危害最大[2]。通过对我国柑橘黄龙样品进行16SrRNA 基因的扩增以及测序分析发现，我国柑橘黄龙病菌均为CLas[3-4]。柑橘感染黄龙病后叶片会出现均匀黄化、斑驳黄化以及缺素状黄化等症状，同时植株不定期抽稍，开花多而早，座果率低，果实小而畸形，果实成熟期出现“红鼻子”果、“青果”等典型症状[5]。

黄龙病作为系统性侵染病害，其病原在染病植株内分布并不均匀[3， 6-16]。郭亨玉等[7]发现染病贡柑橘络中的CLas 浓度最高且显著高于其他部位（果实中轴、新叶等）。陈燕玲等[8]发现同一病枝的“红鼻子果”中CLas 浓度高于叶片的，而斑驳老叶的CLas 浓度低于新叶。健康植株在染病后，体内的病原菌浓度分布并不均匀，不同组织间也存在差异[9]。娄兵海等[11]发现柑橘花器和种子中的CLas 分布不均，其中种皮组织浓度最高，花粉浓度最低。FANG 等[13]发现CLas 在染病沙糖桔的果皮内分布不均匀，倾向于定植于果皮的中间或远端（茎端）区域。KUNTA 等[14]發现葡萄柚和甜橙的花梗、果轴、叶中脉的CLas 浓度明显高于其他部位。LOUZADA 等[15]发现在树的北侧CLas 浓度显著高于南、西两侧；而对于树的根部，土壤表层及水平生长根中的CLas 浓度高于深层垂直生长的根。TATINENI 等[16]发现在染病柑橘果柄处的CLas 浓度最高，且显著高于其他部位。

茶枝柑（Citrus reticulata cv. chachiensis）又称新会柑，在广东新会栽培历史悠久，是广东地区的特色农业产品[17]。利用其果皮加工制成的陈皮具有一定的药用价值和经济价值[18]。茶枝柑在感染黄龙病菌后，会出现植株衰退，甚至大幅度减产的情况，严重制约了产业的发展[19]。目前，尚无茶枝柑感染黄龙病后的症状表现及病原在植株中分布情况的系统报道。本研究以广东新会地区感染黄龙病的茶枝柑为材料，对茶枝柑感染黄龙病后的症状进行系统描述，并通过实时荧光定量PCR 对CLas 在茶枝柑枝条不同部位中的含量及分布情况进行分析，为进一步探究CLas 在茶枝柑中的转运规律提供基础，同时也可为筛选高浓度的黄龙病菌材料提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 感染黄龙病的茶枝柑枝条 2021 年11 月于广东省新会市采集具有黄龙病典型症状的茶枝柑带果枝条若干，经Real-time PCR 检测后挑选携带黄龙病菌的带果枝条作为试验材料。挑选来自不同植株的25 枝具有黄龙病典型症状的茶枝柑带果枝条，作为25 个生物学重复。如图1 所示，将每个带果枝条依次分为：新叶、新梢枝条韧皮部、果蒂、橘络、果实中轴、果实枝条叶片、果实枝条韧皮部、下部老叶8 个部分。样品收集后置于–80 ℃保存备用。

1.1.2 感染黄龙病的茶枝柑果实橘络 挑选14 个直径较大且经过检测携带黄龙病菌的茶枝柑果实作为材料，用工具使橘络从果实中完整分离。如图2 所示，每个果实挑取3 条较长并且长度超过5 cm 的橘络，按从果蒂到果实底部的方向进行切段，每1 cm 为一段，只保留前5 段，切碎置于2 mL收集管中，舍弃多余橘络（不足1 cm），收集的橘络用于DNA 提取及CLas 定量检测。

1.2 方法

1.2.1 植物DNA 提取 所有样品分别处理切碎取0.1 g 进行DNA 提取，其中柑橘叶片仅切取叶中脉。提取总DNA 的方法选用OMEGA BIO-TEK公司的植物DNA 提取试剂盒HP Plant DNA Kit（200） （2485-02）。提取的DNA 样品使用超微量紫外-可见光分光光度计NanoDrop one（ThermoFisher Scientific）进行浓度和纯度的测定，并置于–20 ℃保存备用。

1.2.2 柑橘黄龙病菌的检测与定量 使用实时荧光定量PCR 对CLas 进行检测与定量。检测方法参考BAO 等[20]的CLas 定量PCR 检测方法，对所有DNA 样品进行TaqMan 实时荧光定量PCR检测。以已知含有CLas 的茶枝柑DNA 样本为阳性对照，健康茶枝柑DNA 样本为阴性对照，ddH2O 为空白对照，以提取的所有DNA 样品为模板，进行荧光定量PCR 扩增。根据反应后得到的CT 值来判断样品中是否含有柑橘黄龙病病菌（CT 值<32）。

qPCR 使用含有引物目的片段pEASY-T1（TransGen Biotech，全式金生物）重组质粒制作标准曲线，共设置8 个梯度（10 倍稀释），得到标准方程以量化在总DNA 中的CLas 含量。同一枝条不同部位中的CLas 含量以每1 ng DNA 含有的CLas 拷贝数来表示。同一橘络不同片段中的CLas含量=每1 μL DNA 的CLas 拷贝数×提取的总DNA 体积。

1.3 数据处理

使用SPSS 26 和Microsoft Excel 2019 软件进行试验数据的统计学分析。运用SPSS 26（IBMCorp.，Armonk， N.Y.， USA）单因素方差分析（ANOVA）中的邓肯式复极差检验法（DMRT）进行多重比较，利用Origin 2018（OriginLab Corp.， Northampton，MA 01060， USA）对所得数据进行可视化。

2 结果与分析

2.1 感染黄龙病茶枝柑的症状观察

茶枝柑植株在感染黄龙病后，枝条上部叶片表现为斑驳型、缺素状黄化，尤其是枝条新叶症状较为明显，而下部老叶颜色深绿无黄化，质地较硬（图1）；而感染柑橘黄龙病的茶枝柑果实（图3A～图3C）与健康茶枝柑果实（图3D～图3F）相比，果实着色不均匀，由果蒂向下呈橘红色，接近果实底部颜色接近青绿色，为典型的“红鼻子”果症状，同时感染黄龙病的果实与健康果实相比，大小不均匀，果身不正，呈不对称畸形状；切开果实可见种子极小，种子呈败育症状。

2.2 黄龙病菌在茶枝柑枝条不同部位的分布

通过对感染黄龙病茶枝柑枝条的8 个部位样品进行CLas 检测发现，在25 个染病枝条中，除果实橘络、中轴及老叶能稳定检测到CLas 外，其他部位均有部分样本未检测到CLas，尤其是新梢部位（包括新叶中脉和新梢韧皮部）的阴性样本比其他部位多（表1）。定量结果表明，CLas 在染病茶枝柑枝条中的分布并不均匀（图4），其中果实中轴的CLas 含量最高，橘络次之，2 种组织中的CLas 含量接近均显著高于其他部位（P<0.05）。染病茶枝柑枝条不同部位的CLas 含量从高到低依次为：果实中轴（2 770 162.87±544 972.11）>橘络（2 721 335.84±528 771.21）>果实枝条叶片（530 145.21±382 295.05）>果蒂（339 704.79±67 481.43）>新叶（168 229.39±30 035.39 ） > 果实枝条韧皮部（ 150 789.13±26 500.31）>新梢韧皮部（131 369.40±20 451.80）>老叶（51 952.04±6987.41）。

2.3 黄龙病菌在同一果实同一橘络中的分布

基于染病果实中轴和橘络中具有较高的CLas 含量，本研究进一步以易剥离的橘络组织为材料，探究CLas 在橘络组织中的分布规律。如图5 所示，通过对同一橘络不同长度片段（每1 cm）中的CLas 含量进行比较分析，发现CLas 在同一条茶枝柑橘络中呈不均匀的分布规律，其中位于1～2 cm 位置的橘络片段组织中所含有的CLas 含量（670 933 419.18±133 913 902.91）最高，其次为位于2-3 cm 处的橘络组织片段（595 644 317.71±121 200 818.51）。统计分析表明，位于1～2 cm 和2～3 cm 位置的橘络片段组织中的CLas 含量显著高于位于前端（0～1 cm）和后端（4～5 cm）中的CLas 含量（P<0.05）。

3 讨论

本研究中观察发现茶枝柑在感染黄龙病后，叶片会出现斑驳黄化及花叶症状，果实呈现典型“红鼻子”果，果实畸形不对称，种子败育等症状，这些症状与砂糖橘感染黄龙病后的症状表现极为相似[8， 21]。由于CLas 在果实中分布不均匀，采取更为灵敏的qPCR 方法对柑橘黄龙病菌的检测和定量分析至关重要，而本研究中所采取的TaqMan 实时荧光定量PCR 特异性好，较普通qPCR 更为灵敏[20]，也被广泛使用于CLas 的检测分析中。本研究通过分析感染黄龙病的茶枝柑带果枝条不同部位的CLas 含量，发现CLas 在茶枝柑枝条各部分分布不均匀，主要富集于果实及附近部位（库器官），这一结果与其他品种[7-10， 12]的研究结果类似，本研究中果实中轴的CLas 含量最高，而作为源器官的老叶部分CLas 则最低。TATINENI 等[16]通过电镜观察发现CLas 可通过筛孔在植株中移动，并推测CLas 在植株体内的移动方向与营养流动方向一致，可以从制造营养的源器官（如成熟老叶）转向储存或消耗营养的库器官（如果实、新叶、花等），这可以进一步解释众多研究中CLas 均富集于果实的原因。大多数对柑橘类CLas 分布规律的研究结果表明，橘络上的病菌浓度最高且显著高于其他部位[7-8， 12]，而柚类则是果实中轴的CLas 含量远高于其他部位[12]；本研究中则是在茶枝柑果实中轴上的CLas 含量最高，橘络次之，二者差异虽然不显著，但均显著高于其他部位，与上述2 个品种中的CLas 分布规律有所不同，这可能与果实品种、成熟度、采样时间等因素有关。

对CLas 在橘络中分布规律的研究结果显示，CLas 主要聚集在橘络中部，在靠果蒂处含量最低，与郭亨玉等[7]的研究结果一致。橘络中含有韧皮部和木质部共同组成的维管束组织，为果实运输发育所需的各类营养物质，且与汁囊即果实果肉相连，能够为CLas 的生长提供良好的营养条件和场所[13]，推测由于橘络中部恰好对于果实膨大部位即汁囊更多，营养更丰富，CLas 则能在此处更好地繁殖生长，因此含量更高。果蒂是植株向整个果实输导营养成分的枢纽，张培等[10]通过扫描电镜观察到感染黄龙病的果实果柄的韧皮部筛管细胞杂乱无章，有大量淀粉堆积，堵塞筛管，推测筛管堵塞会阻碍黄龙病菌的移动是造成黄龙病菌分布不均匀的原因之一。另外FANG 等[13]通过透射电镜观察发现CLas 在橘络的韧皮部细胞中也呈不均匀分布，有的韧皮部细胞中充满CLas，而相邻韧皮部细胞则含较少甚至未发现CLas 的存在，这从解剖学上进一步解释了CLas在橘络中分布不均匀的原因。

综上所述，CLas 在染病茶枝柑枝条及同一橘络均呈不均匀分布，并且CLas 在茶枝柑果实中轴及橘络中的浓度显著高于其他部位，CLas 在茶枝柑同一条橘络1～3 cm 片段含量稍高于其他片段，本研究结果可为研究CLas 在侵染柑橘后的转运规律提供理論基础，同时也可为今后快速获得高含量黄龙病菌寻找理想植物材料提供参考依据。