基于网络药理学探讨膜肾协定方治疗特发性膜性肾病的机制

丁秀, 王小琴

湖北省中医院 湖北中医药大学附属医院肾病科,湖北省中医药研究院肾病研究所,湖北武汉 430061

膜性肾病是指以肾小球基底膜上皮细胞下免疫复合物沉积为特征的一组疾病,伴有肾小球基底膜增厚,排除了继发性因素的膜性肾病称为特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)[1]。近年来IMN发病逐年增加,常以水肿、蛋白尿、低蛋白血症、高血压等为主要临床表现,且病程长、预后差、易反复发作[2-3]。膜肾协定方是临床治疗IMN的有效方剂[4-5],然而膜肾协定方治疗IMN的具体机制尚未清晰。本研究采用网络药理学方法探讨膜肾协定方治疗特发性膜性肾病的分子机制,以期为膜肾协定方的临床进一步推广提供参考和依据。

1 材料和方法

1.1 膜肾协定方主要活性成分的作用靶点

本研究通过设置口服生物利用度(OB≥30%)、类药性(DL≥0.18)[6]在BATMAN-TCM(中药分子机理的生物信息学分析工具)、TCMSP(中药系统药理学数据库与分析平台)、TCMID(中药综合数据库)、Swiss Target Prediction、CNKI等数据库收集桂枝、茯苓、防己、黄芪、苍术、白术、柴胡、黄芩、党参、升麻、三棱、莪术相关成分及靶点,建立膜肾协定方成分及靶点数据库,用于后续分析。

1.2 IMN相关靶点的预测与筛选

在GeneCards数据库检索IMN相关靶点,通过比较毒物基因组学(comparative toxicogenomics database,CTD)数据库获取与IMN相关的靶点。将两个数据库获取的IMN相关基因合并删除重复项,得到IMN相关靶点。再将IMN的靶点与膜肾协定方活性成分靶点映射后取交集,获得膜肾协定方治疗IMN的潜在作用靶点。

1.3 靶点交互作用网络的构建

使用STRING[7](Version 10.0)在线数据库进行预测靶点的相互作用。物种设为“Homo sapiens”,对数据进行预读后将置信度设置为≥0.90,并隐藏孤立蛋白,导出TSV文件。进行拓扑排序算法分析,筛选出蛋白-蛋白互作网络(protein-protein interaction,PPI)中的关键靶点。

1.4 KEGG和GO富集分析

使用R studio的cluster Profiler包[8]对所筛选靶点进行GO和KEGG通路分析,选择P<0.05的通路。将上述靶点-通路-中药数据制成Excel表格并导入Cytoscape软件中,对节点参数及网络形状进行设置后绘制膜肾协定方成分调节的网络图。

2 结 果

2.1 膜肾协定方活性成分及靶点的收集与筛选

收集到膜肾协定方中的主要活性成分共34个(表1)。从TCMSP获得466个膜肾协定方靶点,从BATMAN-TCM数据库获得1 262个膜肾协定方靶点,从Swiss Target数据库获得833个膜肾协定方靶点。去重后得到了1 909个靶点。从GeneCards数据库获得8 259个与IMN相关的靶点,从CTD数据库获得了23 610个与IMN相关的靶点,去重后得到了24 171个靶点。将疾病数据库与成分数据库收集到的靶点映射后共得到1 863个膜肾协定方治疗IMN的靶点。

表1 膜肾协定方中的主要活性成分信息表

2.2 蛋白-蛋白相互作用网络的构建

将上述1 863个靶点导入STRING数据库后筛选出148个靶点。以148个靶点作为膜肾协定方在治疗IMN过程中的关键靶点,并建立PPI网络图(图1),共包括148个节点,3 786条边。根据PPI网络图初步推测,膜肾协定方可能通过HRH1、HTR1A、NR3C1、OPRK1、IL-6、JAK3、F2R、MAPK14、MAPK11、MAPK8、TNF、TGF-β1、AKT1、PIK3CA等148个关键靶点防治IMN。

图1 靶点蛋白-蛋白相互作用网络图

2.3 靶点的功能富集分析

KEGG通路分析共得到177条通路,选择P<0.05的20条(图2A),148个靶点主要通过神经活性配体-受体相互作用、信号通路、磷脂酶D信号通路、乙型肝炎、AGE-RAGE信号通路、cAMP信号通路、FoxO信号通路等治疗IMN。将148个靶点进行GO富集,根据P<0.05筛选,148个靶点在生物过程中显著富集(图2B、C、D),共参与生物过程2 430个。根据GO生物学过程富集结果,膜肾协定方可能通过调节细胞钙离子稳态、细胞中的二价无机阳离子稳态、磷脂酶C激活G蛋白偶联受体信号通路、血管直径的调节、血管收缩调节等生物过程防治IMN。

图2 KEGG信号通路图和GO富集图A为KEGG信号通路图;B为GO富集生物过程柱状图;C为GO富集生物过程重点通路图;D为GO富集生物过程靶点-通路图。

2.4 分子机制网络分析

构建中药-靶点-通路的网络图(图3)发现,膜肾协定方在防治IMN的过程中通过多靶点、多通路发挥作用。膜肾协定方主要通过神经活性配体-受体相互作用信号通路、磷脂酶D信号通路、乙型肝炎、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、cAMP信号通路、FoxO信号通路发挥治疗IMN的作用。

图3 膜肾协定方分子调控网络图深绿色正方形代表膜肾协定方中的药物,浅绿色代表靶点,蓝色三角形代表的关键通路。

3 讨 论

IMN归属于“水肿”“尿浊”“慢肾风”等疾病范畴,发病多以脾肾亏虚为本,湿热瘀血为标[4-5]。膜肾协定方由桂枝、茯苓、防己、黄芪、苍术、白术、柴胡、黄芩、党参、升麻、三棱、莪术组成。全方通用,共奏健脾渗湿、活血化瘀之用。本研究通过多数据库整合筛选了膜肾协定方中治疗IMN的34个活性成分。其中,黄芩素可以改善IMN患者高血脂和高血糖状态。有研究表明,黄芩素可以降低IMN患者血液胆固醇及低密度脂蛋白的含量,增强糖耐量,减少胰岛素抵抗,达到降脂降糖的效果[9]。山奈酚可以降低血管炎症反应,预防血管粥样硬化的发生[10-11]。谷甾醇可通过降低组胺所诱导的小鼠毛细血管通透性,抑制核因子-κB通路,提高白细胞介素-10活性,降低PEG2、缓激肽、组胺等炎症介质活性,从而起到缓解IMN患者炎症反应的作用[12-13]。异鼠李素也具有保护肾功能的作用[14]。膜肾协定方中的34个活性成分主要发挥了降糖、抗炎、降低毛细血管通透性等药理学作用。研究发现,益气健脾燥湿类中药具有降糖、抗炎的药理学作用[15-17]。而活血类、破血类中药具有调节血管通透性的药理学作用[18]。膜肾协定方主治与活性成分的药理学作用不谋而和。

本研究发现,MAPK、TNF、IL-6、TGF-β1、AKT1、PIK3CA、JUN等148个靶点是模型中的核心靶点。Baranova等[19]研究发现,NOS通过激活p38MAPK抑制脂多糖信号通路,防治循环系统中脂多糖增加的慢性肾炎。Lee等[20]临床实验表明,AKT与IκB通过PI3K/AKT通路解离后变为活性状态,转位进入细胞核,进而结合核内的κB位点,再进一步调控下游的靶基因表达,从而参与肾脏炎症、肾脏纤维化以及细胞凋亡等病理过程[21]。Yao等[22]研究发现,TGF-β1被激活后,会通过Smad信号通路发挥其生物学和病理学活性,Smad信号转导通路介导TGF-β1诱导的胶原合成,并在IMN的发生发展中起着至关重要的作用[23]。张倩等[24]研究发现,高糖上调系膜细胞TGF-β1基因表达激活,使调控区去甲基化,参与肾病的发展。全墨缘等[25]发现,上调p38MAPK能够改善适应性和固有免疫细胞等多种细胞参与免疫炎性损伤,调节IMN的发展过程。Liu等[26]细胞实验证明,下调VEGFA表达能够抑制TGF-β1/Smad3信号转导肾小管上皮细胞纤维化。因此,膜肾协定方的148个核心靶点可能通过调节纤维化过程、免疫过程、细胞凋亡等过程发挥防治IMN的作用。

KEGG通路富集分析发现,神经活性配体-受体相互作用、信号通路、磷脂酶D信号通路、乙型肝炎、AGE-RAGE信号通路、cAMP信号通路、FoxO信号通路是膜肾协定方发挥治疗IMN作用的主要通路。其中,通过Hepatitis B通路增加发生胰岛素抵抗的风险,导致胰岛β细胞凋亡,增加了肾纤维化风险[27];通过AGE-RAGE信号通路使肝糖原储存增加,出现脂质代谢异常,增加血浆中IL-6产生,增加IMN复发的风险[28];通过FoxO信号通路导致氧化应激,使NF-κB信号通路受损导致IMN的发生;通过cAMP信号通路使cAMP表达水平异常促进成纤维细胞的增殖,增加AngII/TGF-β1诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞转变及胶原的合成,增加细胞外基质沉积,增加肾纤维化的风险[29]。因此,膜肾协定方的核心通路可能通过调节肝糖原储存、胰岛素抵抗、氧化应激、细胞外基质的沉积等过程发挥防治IMN的作用。

综上所述,膜肾协定方发挥治疗作用主要体现在以下两方面:①膜肾协定方通过Hepatitis B、AGE-RAGE等通路上调JAK3、MAPK8、MAPK14、MAPK11等靶点的表达,抑制胰岛β细胞凋亡,降低了肾纤维化风险;②膜肾协定方通过FoxO信号通路、NF-κB、cAMP信号通路等上调TGF-β1、PIK3CA、PIK3CB、EGFR的表达,调节促纤维化因子、活性氧累积和全身炎症,降低肾损伤和IMN发生的可能性。本研究进一步阐明了膜肾协定方的物质基础及关键靶点群,并系统地揭示了膜肾协定方治疗IMN的网络作用机理,为IMN的诊疗手段提供新策略。