一步细管冷冻解冻牛胚胎移植效果试验

韩志强,张洪涛,许红喜,李长志,李 伟,王洪亮

( 黑龙江省农垦科学院 畜牧兽医研究所, 哈尔滨 150038 )

目前胚胎移植技术作为国内奶肉牛快速扩繁的重要手段之一,应用广泛。该技术可以充分发挥公母畜遗传优势,对于实现奶肉牛品种改良、快速扩繁意义重大[1]。胚胎移植技术作为牛良种快速扩繁的重要途径,可以提高母畜繁殖效率,加速遗传进展,缩短世代间隔,更高效地获得优质高产个体。已有文献表明,影响胚胎移植效果的因素较多,包括解冻胚胎时空气浴环境温度、胚胎质量、受体牛胎次、生理状态及病理状态等[2]。胚胎移植过程中胚胎在母体子宫着床率直接影响胚胎移植技术的应用效果,胚胎离开母体后在另一个子宫内着床是一种高度进化和完善的生理过程[3],因而,受体妊娠率一直是各国从事生殖技术研究的科研人员所关注的焦点之一。

相较于人工输精而言,胚胎移植技术要求高,移植受胎率低,如何提高一步细管胚胎解冻复苏效果是从业人员急需解决的问题。本研究将一步冷冻胚胎解冻后推入保存液中洗脱乙二醇,再通过胚胎形态学鉴定方法进行质量鉴定、移植,与常规一步细管冷冻胚胎解冻后直接装入输胚枪内移植进行对比。通过比较冷冻胚胎解冻后不同处理方式对受胎率的影响,探讨冷冻胚胎解冻后延长体外停留时间对降低胚胎冷冻保护剂对胚胎和受体牛受胎率影响的可能性,为进一步提高一步细管冷冻胚胎移植受胎率提供理论参考和技术支持。

1 材料与方法

1.1 胚胎及受体牛的选择

胚胎,由黑龙江省农垦科学院畜牧兽医研究所提供,均为同种同批次冷冻胚胎(胚龄7 d,乙二醇作冷冻保护剂生产胚龄7 d的体内胚胎)。

受体牛,选用澳大利亚进口原种西门塔尔牛、 国内自繁荷斯坦牛共200头,分别在黑龙江省四方山农场肉牛繁育基地和北安农垦长鑫牧场专业合作社饲养。

受体牛选择标准:13～16月龄青年母牛,无繁殖疾病,发情周期正常,膘情良好。

受体牛散栏式自由采食,精饲料主要成分为玉米、豆粕、5%预混料和食盐;粗饲料选用优质羊草、燕麦草、全株玉米青贮。在移植前30 d补充蛋白质(半干苜蓿草)及微量元素(添砖)。

1.2 主要仪器、药品和试剂

双目体视镜,型号为奥林巴斯SZ61;恒温台,为日本东海希多品牌;氯前列醇钠, 宁波第二激素厂生产; 维生素AD,购自北京立时达药业有限公司;孕激素阴道栓,为新西兰生产;移植枪及外套,法国生产。以上仪器、设备、耗材均来源于黑龙江省农垦科学院畜牧兽医研究所实验室。

1.3 试验分组及处理

1.3.1 试验分组

2022年6月—2023年3月分为 A(2022年6月,西门塔尔牛为受体牛) 、B(2022年10月,荷斯坦牛为受体牛)、C(2023年3月,荷斯坦牛为受体牛)三个时间段开展受体牛移植试验,将受体牛按照不同冷冻胚胎解冻后处理方式分为试验组和对照组 。

1.3.2 试验组处理

试验组(脱除冷冻剂):将冷冻胚胎从液氮罐取出后停留空气浴10 s,投入32 ℃水中解冻,待冰晶完全溶化后取出,擦净细管上的水珠,拔出细管塞,将胚胎推入装有胚胎保存液的35 mm平皿内洗脱冷冻保护剂中,再转移到另一个装有保存液的35 mm平皿内,参照国际胚胎移植学会推荐的胚胎形态学方法进行质量鉴定评级。透明带完整或有裂痕均视为合格胚胎,卵裂球破碎视为不可移植胚胎。更换新鲜胚胎保存液后重新装入0.25 mL细管内进行移植。

对照组(一步解冻):将冷冻胚胎从液氮罐取出后停留空气浴10 s,投入32 ℃水中,待冰晶完全溶化后取出,擦净细管上的水珠,拔出细管塞,装入移植枪内并做好保温, 输入受体牛有黄体一侧的子宫角深处。

1.4 同期发情

受体牛除发情当天外的任意一天于阴道内放入 CIDR,同时肌注10 mg维生素AD,黄体酮100 mg,雌二醇5 mg,记为第0天 ,第7天上下午各肌注PGF 2α 0.5 mg。第9天上午撤CIDR同时肌注10 mg维生素AD,准确观察发情,并记录发情时间。

1.5 移植

1.5.1 黄体检查

采用直肠检查方式对发情6～8 d的受体牛进行黄体检查。

检查标准:受体牛黄体丰满,触摸黄体明显突出于卵巢表面,质地柔软充实,呈火山口形;卵巢上无大卵泡共存。

1.5.2 胚胎植入

(1)取出胚胎空气浴10 s;(2)投入32 ℃水中,待冰晶完全溶化后取出;(3)擦净细管上水珠并装入移植枪; (4) 将移植枪输入有黄体一侧子宫角深处,操作时要尽量避免子宫受伤、减少子宫刺激,从胚胎解冻开始到输胚完成时间要求5～7 min[2]。

1.6 移植效果判定

对受体牛进行跟踪观察,在移植30,60天时分别进行B超检查,统计受胎数,计算受胎率。

1.7 数据的统计分析

试验数据采用 Microsoft Office Excel 2016进行数据统计和预处理,采用SPSS 22进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 试验组解冻镜检移植效果

在2022年6月、2022年10月、2023年3月开展三批移植试验,试验组共解冻胚胎130枚,126支细管直接将胚胎推出,4支细管经清洗细管棉塞得到(胚胎吸附在0.25 mL细管内壁,无法随液流推出,将棉塞推至细管对侧出口进入胚胎保存液平皿中)。透明带完整的102枚,透明带有裂痕的19枚,透明带破损的6枚。卵裂球破损的3枚未做胚胎移植。共移植127头受体牛,30 d孕检妊娠77头,移植妊娠率为60.6%,60 d孕检妊娠75头(2头早期流产),移植妊娠率为59.1%。分批分期的孕胎情况见表1。

表1 冷冻胚胎移植后受胎情况Tab.1 Conditions of implantation after frozen embryo transfer

2.2 对照组解冻移植效果

对照组共解冻胚胎105枚,解冻时水浴过程中细管塞蹦出,导致未完全融化的冰晶液体溢出而损失2枚胚胎;移植胚胎103枚,30 d孕检妊娠50头,移植妊娠率为48.5%;60 d孕检妊娠49头(1头早期流产),移植妊娠率为47.6%。分批分期的孕胎情况见表1。

3 讨论与结论

当下程控冷冻仪生产的牛体内胚胎进行移植时,大多数技术人员主要采取空气浴加水浴一步法解冻移植,该项技术采用的冷冻保护剂主要为乙二醇[4-5],该方法减少了脱出冷冻保护剂程序,便于现场操作,提高工作效率。此冷冻保护剂对胚胎具有一定的毒性,要求技术人员从胚胎解冻到移植枪插入输出胚胎在5～7 min内完成。如在一些受体牛保定困难或是子宫颈口不宜通过的时候很难在5～7 min内完成胚胎植入。胚胎在解冻后尽快脱除保护剂(子宫内或是保存液内)提高胚胎复苏效果是非常必要的,一方面是因为冷冻保护剂对胚胎有一定的毒性, 在常温下这种毒性更大。另一方面,部分冷冻胚胎细管内除中间胚胎段是冷冻液,其他液段也都是冷冻液未吸入保存液段,把有较高浓度冷冻保护剂的胚胎直接移植到受体的子宫中,由于细胞内外存在较高的渗透压差,大量的水分子进入细胞而使其膨胀。而胚胎保存液中含有较高浓度的非渗透性溶剂,如蔗糖等。蔗糖在稀释细胞内保护剂时,起到缓冲渗透压的作用,从而维持了细胞外液较高的渗透压,使细胞内保护剂渗出,同时控制细胞外水分渗入的速度和渗入量,防止因水分的迅速渗入而导致细胞过度膨胀,减少了细胞渗透性休克的发生[6]。本研究通过解冻脱冷冻保护剂后进行质量鉴定,二次筛选重新装管的方式,洗脱胚胎冷冻保护剂最大限度减少了胚胎冷冻液对胚胎的损伤,能解放传统胚胎移植解冻后5～7 min内必须将胚胎移植操作完成,以防胚胎出现异常或损伤的限制[7]。

胚胎冷冻如采用液氮冷冻介质的CL5500或者CL8800冷冻仪,胚胎细管竖直插入方式,在冷冻室内平衡过程中会导致部分胚胎下沉到冷冻保护液底部,水浴解冻时细管内各液段内产生的气泡有导致解冻后胚胎脱离液体环境而吸附于气泡上,从而降低活力的风险,采用质量鉴定法可以弥补这一漏洞,可在极短时间内将胚胎浸入保存液内,提升复苏效果,达到较高的受胎率,降低犊牛生产成本。通过胚胎移植前质量鉴定可现场判定该次胚胎移植所用胚胎的数量及质量;常规解冻后直接移植,不能直观反映胚胎数量及质量,如胚胎吸附在棉塞上未有效输入等情况。而采用解冻法移植前处理可有效避免胚胎发生未植入性着床导致的失败。

本研究结果表明,冷冻胚胎经过脱除冷冻保护剂再移植受胎率的效果显著好于常规一步法移植。且质量鉴定后,胚胎受胎率与张震等[8]报道的牛鲜胚移植受胎率一般在50%以上、冷冻胚一步移植法妊娠率一般在41.5%～48.3%相吻合;与其不同之处在于,本研究中冷冻胚胎解冻后先进行质量鉴定,再重新装管处理后进行胚胎移植的试验组,第30,60天的胚胎受胎率均显著高于对照组。与张秀陶等[9]报道的“解冻后重新鉴定装管移植效果差异不显著”不同,本试验也未发生其报道的解冻后胚胎丢失现象。

然而,冷冻胚胎解冻后进行二次质量鉴定、装管对于操作环境及操作人员技术水平均有一定的要求,需配有专业胚胎质量鉴定技术人员和操作间,不适于在基层单位推广使用。本研究结果表明,经质量鉴定重新装管后胚胎移植受胎率较直接移植法有显著提高。此种对冷冻胚胎预处理后移植的方式对于规模化牧场大批量生产胚胎犊牛或部分生产单位开展高价值种用级胚胎移植具有参考价值,同时也为进一步提高胚胎移植效果提供了可能性。

综上所述,冷冻胚胎解冻镜检可以减少胚胎丢失,脱除冷冻保护剂可以增加优质胚胎利用率,使冷冻胚胎达到鲜胚移植受孕效果。同时可以考虑将解冻破碎的胚胎组织与完整胚胎进行组合移植,以增强移植受体牛妊娠信号,该项技术可以有效提高胚胎移植受胎率、受体牛只利用率。