禽腺病毒血清4型中国流行株fiber2蛋白单克隆抗体制备与鉴定

田开月，曲信芹，韩城昊，尹坤，杨盼盼，黄玉波*，赵军*

(1. 周口市农业科学院，河南 周口 466000；2. 青岛蔚蓝生物股份有限公司，山东 青岛 266000；3. 河南农业大学动物医学院，河南 郑州 450046)

禽腺病毒(fowl adenovirus，FAdVs)属于腺病毒科禽腺病毒属[1]，包含3个亚群。I群禽腺病毒根据血清交叉中和试验和限制性酶切图谱可分为A、B、C、D、E 5个种，12个血清型[2]，其中，禽腺病毒血清4型(FAdV-4)引起鸡肝炎-心包积液综合征(hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS)。FAdV-4主要感染3～6周龄的肉鸡，感染鸡表现精神沉郁、羽毛松乱、拉白色和绿色稀粪等临床症状，剖检可见心包有淡黄色积液、包涵体肝炎和肾炎等病理变化，死亡率高达80%～90%[3-4]。2015年在我国主要养禽省份暴发的HHS，给我国养禽业造成了巨大经济损失[5-8]。

FAdV-4为基因组长约45 kb的无囊膜双链DNA病毒，病毒粒子呈二十面体对称结构，六邻体蛋白(hexon)、纤维蛋白(fiber)和五邻体基座蛋白(penton base)为病毒衣壳主要组成部分。 其中fiber与penton base相连，形成二十面体病毒衣壳的顶端。fiber蛋白在介导病毒感染、决定病毒致病性和诱导特异性中和抗体方面发挥着重要作用，FAdV-4每个五邻体基座上有fiber1和fiber2两种长度不同的fiber蛋白[9-11]。现有的研究显示，fiber1在介导FAdV-4病毒的感染中发挥关键作用，而fiber2在致病性和诱导机体产生保护性免疫反应中发挥重要作用，但其具体作用机制尚有待进一步深入研究[12-13]。

FAdV-4的有效防控依靠快速诊断和疫苗免疫。现有诊断以检测病毒核酸的分子生物学方法为主，目前防控FAdV-4感染的商品化疫苗包括全病毒灭活疫苗和fiber2蛋白亚单位疫苗[14-15]。养禽业需要检测FAdV-4抗原和抗体的血清学方法，以便实现FAdV-4感染的血清学监测和疫苗免疫效果的评价。本研究用纯化的FAdV-4中国流行株免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤细胞技术获得2株分泌抗FAdV-4 fiber2蛋白抗体的杂交瘤细胞株，为建立FAdV-4的血清学诊断和评价疫苗效力的方法，以及fiber2蛋白功能的进一步研究提供了研究材料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SP2/0骨髓瘤细胞由河南农业大学传染病实验室提供；FAdV-4中国流行株CH/HNJZ/2015(GenBank登录号KU558760)、新城疫病毒(NDV)La Sota疫苗株、传染性支气管炎病毒(IBV)M41株、传染性法氏囊病病毒(IBDV)HQ株、H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)HP株、减蛋综合征病毒(EDSV)Z16株均由河南农业大学禽病研究所保存；鸡肝癌细胞系(LMH)购自美国ATCC公司；6周龄 BALB/c 小鼠购自山东朋悦动物中心；胎牛血清购自Biological Industries公司；RPMI1640培养基、DMEM/F-12培养基购自Hyclone公司；弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、次黄嘌呤氨基喋啶(HAT)、次黄嘌呤(HT)、PEG1500购自Sigma公司；鼠单抗Ig分型试剂盒、HRP标记的羊抗鼠IgG、FITC羊抗鼠IgG购自Proteintech公司。

1.2 FAdV-4扩增与纯化

将FAdV-4 接种于LMH细胞单层，待细胞病变达90%时收取细胞，反复冻融3次后，6 000 r/min 4 ℃离心30 min，收取上清进行蔗糖梯度离心。

1.3 动物免疫

将纯化后的FAdV-4用终浓度0.02%的甲醛灭活后与等体积的弗氏完全佐剂乳化，采用皮下多点注射方式免疫6周龄BALB/c小鼠3只，分别命名为1号鼠、2号鼠和3号鼠。其后每隔10 d分别进行二免和三免，用弗氏不完全佐剂与等体积的FAdV-4乳化后皮下多点注射。三免10 d后尾部静脉采血，使用前期建立的间接 ELISA测定血清效价[16]。选择ELISA效价高于1∶10 000 的小鼠，在融合前3 d用纯化的FAdV-4腹腔注射进行冲刺免疫。

1.4 细胞融合与单克隆抗体制备

1.4.1 细胞融合及杂交瘤细胞的筛选

取冲刺免疫后3 d的小鼠的脾脏组织，分离脾细胞后与SP2/0 细胞用PEG1500进行融合。融合后3 d，用含有HAT的RPMI 1640筛选培养基继续培养。用以fiber2蛋白为包被抗原的间接ELISA筛选能够分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。选取检测结果为阳性、生长状态良好的细胞进行转孔、亚克隆以及冻存。

1.4.2 腹水的制备与纯化

取0.5 mL弗氏不完全佐剂对2只16周龄雌性BALB/c小鼠进行腹腔注射，9 d后分别腹腔注入106个对数生长期的2株可分泌抗fiber2蛋白抗体的杂交瘤细胞。待小鼠腹部明显膨大，采集腹水，利用优球蛋白沉淀法纯化单克隆抗体。

1.5 单克隆抗体的鉴定

1.5.1 亚型鉴定

按照鼠单克隆抗体Ig亚类鉴定试剂盒说明书操作，对获得的小鼠腹水单克隆抗体进行亚类鉴定。

1.5.2 反应原性鉴定

取纯化的FAdV-4感染的LMH细胞裂解液、fiber2蛋白和正常的LMH细胞裂解液进行SDS-PAGE，转膜，以制备的小鼠腹水作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，同时设置阴性对照，对所制备小鼠腹水与FAdV-4及其fiber2蛋白的反应原性进行Western blot分析。

1.5.3 特异性鉴定

分别以超速离心纯化的NDV La Sota疫苗株、IBV M41株、IBDV HQ株、H9N2 AIV HP株、EDSV Z16株作为包被抗原(1 μg/孔)，纯化的fiber2蛋白作为阳性抗原对照，用间接ELISA方法检测所制备小鼠腹水的特异性。

1.5.4 间接免疫荧光(IFA)检测单克隆抗体与FAdV-4 fiber2蛋白的反应性

利用实验室前期构建的表达FAdV-4 fiber2蛋白的重组NDV La Sota株rLa Sota-fiber2和NDV La Sota株分别感染DF1细胞，同时设立未感染的细胞为空白对照。在感染后24 h，用4%多聚甲醛室温固定细胞30 min，PBST洗涤；用0.1%的Triton X-100室温透化30 min，PBST洗涤；用含1% BSA的PBST作为封闭液，室温作用1.5 h，PBST洗涤；用制备的小鼠腹水作为一抗，用封闭液稀释(1∶100)，4 ℃过夜，PBST洗涤3遍；用FITC羊抗鼠IgG(1∶2 000)作为二抗37 ℃ 1 h，PBST洗3遍后，在荧光显微镜下观察。

1.6 中和活性检测

采用固定病毒稀释抗体的方法检测所制备单克隆抗体的中和活性。将制备的杂交瘤细胞的小鼠腹水原液进行2倍倍比稀释，与等体积的100 TCID50FAdV-4病毒液混合，37 ℃作用1 h，然后接种于96孔细胞培养板中的LMH细胞单层，每个稀释度设置3个重复，同时设置空白对照，置于细胞培养箱培养。连续7 d每日观察细胞病变，鉴定所制备单克隆抗体对FAdV-4的中和活性。

2 结果

2.1 小鼠抗体效价的测定

3次免疫后第10天，测定免疫小鼠血清中抗fiber2蛋白的抗体效价。结果显示，3号小鼠抗体水平较高，稀释10 000倍后OD450 nm仍然达到1.5以上。为保证融合成功率，选取3号小鼠进行冲刺免疫后，取其脾细胞进行细胞融合(图1)。

图1 间接ELISA检测三免后小鼠血清中抗FAdV-4 fiber2蛋白抗体

2.2 杂交瘤细胞的筛选及亚型鉴定

融合的杂交瘤细胞经过5轮亚克隆后，获得2株能够稳定分泌抗fiber2蛋白抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2C3和7B4。将相应的杂交瘤细胞扩大培养后，分别注射到小鼠腹腔制备腹水。利用鼠单克隆抗体亚类分型试剂盒鉴定抗体亚型。结果显示，获得的单克隆抗体均为IgM亚型,轻链均为Kappa型(图2)。

图2 单克隆抗体亚型和轻链类型鉴定

2.3 单克隆抗体反应原性分析

采用Western blot检测所获得的2株单克隆抗体腹水与FAdV-4及其fiber2蛋白的反应性。结果显示，获得的2株单抗均可与FAdV-4及其fiber2蛋白特异性反应，在66 kDa左右出现特异性反应条带，其中单抗7B4与FAdV-4及其fiber2蛋白的反应性较强(图3B)；2株单抗均与阴性对照无反应(图3)。

M.蛋白Marker；1. FAdV-4全病毒；2.fiber2蛋白；3.LMH细胞对照。

2.4 单克隆抗体特异性的鉴定

为了鉴定抗FAdV-4 fiber2蛋白单抗的特异性，利用间接 ELISA 方法检测获得的单克隆抗体腹水与FAdV-4及其他常见家禽病毒的反应情况。结果显示，获得的2株单克隆抗体均能够与FAdV-4及其fiber2蛋白发生特异性反应，与禽的其他常见病原NDV、IBV、IBDV、H9N2亚型AIV和EDSV等均无交叉反应(图4)。

图4 单克隆抗体特异性鉴定

2.5 单克隆抗体IFA鉴定

为了进一步检测单克隆抗体与FAdV-4 fiber2蛋白的反应性，本研究利用间接免疫荧光检测2C3和7B4单克隆抗体腹水与真核细胞中表达的fiber2蛋白的反应性。图5结果显示，2C3和7B4单克隆抗体腹水均能够识别重组病毒rLa Sota-fiber2感染的DF1细胞中表达的fiber2蛋白，产生特异性荧光，而La Sota疫苗株感染的DF1细胞和空白对照均未出现特异的荧光，说明获得的单克隆抗体也能够特异性识别天然构象的fiber2蛋白，可用于后续FAdV-4的检测和fiber2蛋白功能的相关研究。

图5 IFA检测单克隆抗体2C3和7B4与细胞中表达的FAdV-4 fiber2蛋白的反应性

a. 正常细胞对照；b～g. 添加单抗，浓度分别为1∶4、1∶16、1∶64、1∶256、1∶1 024和1∶4 096；h. FAdV-4感染对照。

2.6 单克隆抗体中和活性的鉴定

在鉴定单克隆抗体腹水能够特异性识别FAdV-4及其fiber2蛋白的基础上，本研究检测了单克隆抗体对FAdV-4的中和活性。图6结果显示，2C3和7B4单克隆抗体腹水在1∶256稀释条件下依然能够有效阻断FAdV-4导致的细胞病变，说明获得的2株单克隆抗体均具有良好的FAdV-4中和活性。

3 讨论

自2015年以来，由FAdV-4导致的HHS在我国主要养禽省份暴发流行，给我国养禽业造成了严重的经济损失[5-8]。建立FAdV-4抗原和抗体的检测方法对于监测FAdV-4的流行和评价FAdV-4相关疫苗的免疫效力，以及制定有效防控HHS的措施均至关重要。fiber2是FAdV-4的主要结构蛋白之一，与FAdV-4的致病性密切相关，同时含有型特异性抗原表位，且可以诱导机体产生病毒中和抗体[11-14]。因此，fiber2是研制FAdV-4亚单位疫苗，建立FAdV-4检测方法和解析FAdV-4致病机理的重要靶标。单克隆抗体的突出优点是特异性好，利用针对fiber2的单克隆抗体可以建立检测FAdV-4及其fiber2蛋白的抗原夹心ELISA和间接免疫荧光等方法，也可以建立检测抗FAdV-4及其fiber2抗体的竞争ELISA。在研究FAdV-4的致病机理方面，抗fiber2单克隆抗体可以用于fiber2蛋白的亚细胞定位、fiber2蛋白与宿主互作蛋白的鉴定等。

国内已经有多个单位制备了抗FAdV-4的fiber2蛋白的单克隆抗体。谢明等[17]利用大肠杆菌表达的fiber2蛋白作为免疫原和筛选抗原，获得多株能稳定分泌抗fiber2蛋白单抗的杂交瘤细胞，所制备的单克隆抗体在斑点杂交和间接免疫荧光试验中能较好地识别FAdV-4及其fiber2蛋白，但不能在Western blot试验中识别上述抗原，对于所制备的单抗是否具有病毒中和活性也没有报道。朱荣芳等[18]利用大肠杆菌表达的fiber2 Head蛋白作为免疫原和筛选抗原制备了相应的单克隆抗体，制备的单克隆抗体在ELISA、Dot-blot、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)和IFA等试验中均可特异性识别 fiber2 Head 蛋白和 FAdV4，但在 Western blot 试验中没有杂交反应。同样，所制备单克隆抗体是否具有病毒中和活性也不得而知。王萍等[19]利用FAdV-4全病毒作为免疫原，用纯化的原核表达的fiber2蛋白作为筛选抗原，研制出了4株针对FAdV-4的单克隆抗体，其中单克隆抗体3C2在体外能有效抑制FAdV-4的感染，但4株单克隆抗体也均不能识别Western blot试验中的fiber2蛋白。郭瑞珍等[20]利用原核表达的可溶性重组蛋白 NusA-fiber2作为免疫原，筛选获得3株能稳定分泌抗fiber2蛋白的杂交瘤细胞株，所获得的单克隆抗体具有良好的Western blot和IFA反应性，但病毒中和活性较低。综上所述，目前抗FAdV-4 fiber2蛋白单克隆抗体存在的主要问题是在Western blot试验中不能识别fiber2蛋白和不具有良好的病毒中和活性。

本研究利用纯化的FAdV-4中国流行株全病毒作为免疫原对小鼠进行免疫，用纯化的大肠杆菌表达的可溶性fiber2蛋白作为筛选抗原，成功获取2株分泌抗fiber2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所制备的单克隆抗体2C3和7B4在Western blot和IFA中均能识别FAdV-4及其fiber2蛋白，同时还具有良好的FAdV-4特异性和中和活性。结合国内其他单位制备抗fiber2单克隆抗体的结果，或许利用FAdV-4全病毒作为免疫原，利用可溶性的fiber2蛋白作为筛选抗原是获得具有优良免疫反应原性和病毒中和活性单克隆抗体的较好策略。关于小鼠的免疫次数和免疫间隔，多数研究人员采用3次连续免疫和1次冲刺免疫。免疫的间隔采用间隔10 d或间隔2周不等，但通常是在第3次免疫后用ELISA或IFA测定免疫小鼠血清中的特异性抗体效价，然后取抗体效价较高的小鼠进行冲刺免疫，收获其脾细胞进行后续的细胞融合[17-21]。本研究采用间隔10 d进行3次连续免疫，选择ELISA效价为1∶10 000 的小鼠，在融合前用纯化的FAdV-4腹腔注射进行冲刺免疫，然后取其脾细胞进行融合，最终获得了性能较好的单克隆抗体。至于采取几次免疫和多长的免疫间隔时间，目前尚无统一的标准。但根据作者的经验，无论采用哪种免疫策略，选取免疫后ELISA抗体效价在1∶10 000 以上的小鼠脾细胞进行细胞融合，通常能够得到性能良好的单克隆抗体。此外，在单克隆抗体的筛选过程中，要采用ELISA、IFA和Western blot多种筛选方法，以便获得具有多种优良特性的单克隆抗体。总之，本研究研制的抗FAdV-4 fiber2蛋白单克隆抗体，为FAdV-4检测方法的建立及fiber2蛋白功能的深入研究提供了研究材料。