棕榈酸诱导小鼠精原细胞株GC-1细胞凋亡的作用机制

邓 何, 赵海霞, 周本文, 常言语, 陈思敏, 杨焱娜, 付国庆, 张长城

(1. 三峡大学国家中医药管理局中药药理科研三级实验室,2.三峡大学基础医学院,3.三峡大学健康医学院,湖北 宜昌 443002)

临床研究发现,肥胖可导致男性精子浓度和活力下降、精子DNA损伤以及性腺功能减退,从而对男性生殖功能产生负面影响[1]。动物实验亦表明,高脂饮食可诱导大鼠[2]和小鼠[3]睾丸生精细胞凋亡,精子数量减少,进而导致生殖功能障碍,甚至不育。因此,抑制高脂所致生精细胞凋亡是治疗肥胖男性不育的重要措施之一。

研究证实[5],内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是细胞凋亡的关键因素[4]。ERS激活会触发内质网(endoplasmic reticulum,ER)未折叠蛋白质反应(unfolded protein response,UPR),细胞通过减少蛋白质翻译、降解错误折叠蛋白以及促进错误折叠蛋白质重新折叠以缓解ER压力,恢复ER功能。然而,持续或严重的ERS会激活细胞凋亡通路,诱导细胞凋亡。研究证实,高脂诱导的HepG2细胞凋亡与ERS直接相关[6]。但高脂所致的生精细胞凋亡是否与ERS相关,目前未见研究报道。

在肥胖人群中,游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)的水平异常升高,棕榈酸(palmitic acid,PA)作为血浆中最常见的一种FFA,被广泛应用于高脂细胞模型的建立[7]。本研究采用PA处理小鼠精原细胞株GC-1细胞模拟体外高脂损伤模型,观察PA对精原细胞凋亡蛋白以及ERS相关蛋白表达的影响,初步探讨ERS在高脂所致的GC-1细胞凋亡中的作用机制。

1.1 材料

1.1.1细胞系 GC-1细胞购自湖南丰晖生物科技有限公司。

1.1.2试剂 PA(P5585)购自Sigma-Aldrich;不含脂肪酸的牛血清白蛋白-V(BSA-V,A8850)购自Solarbio;DMEM/F12培养基(C11330500BT)购自Thermo Fisher Scientific;caspase-3活性检测试剂盒(C1115)、RIPA裂解液(P0013B)购自Beyotime;AnnexinⅤ-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(KGA106)购自KeyGEN;ECL化学发光试剂盒(G2014)、蛋白上样缓冲液(G2013-1ML)购自Servicebio;MTT(M8180)购自Solarbio;Bax(50599-2-ig)、BCL2(26593-1-AP)购自Proteintech;cleaved caspase-3(MAB835)购自R&D Systems;GRP78(abs130538)、p-PERK(abs137056)购自Absin;CHOP(sc-56107)、ATF6(sc-166659)购自Santa Cruz;caspase-12(#35965)、IRE1(#3294)、PERK(#3192)购自Cell Signaling Technology;p-IRE1(ab48187)、XBP1(ab37152)、ATF4(ab184909)、eIF2α(ab5369)、p-eIF2α(ab32157)购自Abcam;Goat anti-Mouse IgG(115-035-003)购自Jackson Immunoresearch;Goat anti-Rabbit IgG(KR0023)购自武汉科瑞生物技术有限公司。

1.1.3仪器 生物洁净工作台购自Airtech,CO2培养箱购自Thermo Fisher Scientific,台式冷冻离心机购自上海天美科学仪器,光学倒置显微镜购自Olympus,电泳仪购自Bio-Rad,全波长酶标仪购自Tecan,化学发光成像系统购自上海勤翔科学仪器,流式细胞仪购自常州必达科生物科技,摇床购自海门其林贝尔。

1.2 方法

1.2.1PA的配制 在70 ℃水浴锅中,将PA溶解在0.1 mmol·L-1的NaOH中,制成40 mmol·L-1PA皂化液。在50 ℃水浴锅中溶解BSA-V制成质量分数为10%的BSA溶液。将上述PA皂化液与BSA溶液配制成8 mmol·L-1的PA母液,过滤、分装,将母液用培养基稀释。

1.2.2细胞培养 GC-1细胞使用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,在37 ℃,5% CO2培养箱中培养。

1.2.3实验分组 将细胞分为Control组(正常培养,不给予任何试剂干预)、Vehicle组(仅含BSA,作为溶剂对照组)、PA组(100、150、200、250 μmol·L-1),各组细胞均处理48 h。

1.3 检测指标

1.3.1MTT法检测细胞增殖活力 GC-1细胞接种于96孔板(细胞数量:1×104个/孔),培养24 h后,不同浓度PA处理48 h,加入10 μL MTT,37 ℃下孵育4 h,弃上清,加入200 μL DMSO,震荡10 min,使用酶标仪在490 nm处检测每孔的吸光度值,计算各组细胞活力。

1.3.2流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 GC-1细胞接种于6孔板(细胞数量:3×105个/皿),培养24 h后,不同浓度PA处理48 h,按Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明处理细胞,使用流式细胞仪进行检测,图中:左上/Q1-1代表坏死的细胞,右上/Q1-2代表晚期凋亡的细胞,左下/Q1-3代表正常细胞,右下/Q1-4代表早期凋亡的细胞,右上/Q1-2和右下/Q1-4之和在所有细胞中的占比即为细胞凋亡率,检测三批细胞并计算各组细胞的平均凋亡率。

1.3.3caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性 GC-1细胞接种于6孔板,(细胞数量:3×105个/皿),培养24 h后,不同浓度PA处理48 h,按caspase-3活性检测试剂盒说明处理细胞,使用酶标仪在405 nm处检测每孔的吸光度值。

1.3.4Western blot检测 GC-1细胞接种于6孔板,(细胞数量:3×105个/皿),培养24 h后,不同浓度PA处理48 h,预冷的PBS清洗残余培养基,吸干残余液体,每孔加入100 μL RIPA裂解液,裂解30 min,收集细胞,冰上继续裂解15 min,4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min,将上清转入1.5 mL EP管中,BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度,蛋白中加入1/5体积Loading Buffer于70～100 ℃水浴锅中变性10～15 min,SDS-PAGE蛋白电泳,250 mA转膜,封闭液封闭1 h,一抗4 ℃孵育过夜,洗膜,二抗室温孵育1 h,洗膜,ECL化学发光液浸润条带,化学发光成像系统显影。

2 结果

2.1 PA对GC-1细胞增殖活力的影响MTT实验结果显示,与Vehicle组相比,PA处理GC-1细胞48 h后,细胞增殖活力呈浓度依赖性下降,在PA浓度达到250 μmol·L-1及以上时,细胞活力下降到50%以下(Fig 1)。

2.2 PA对GC-1细胞凋亡率的影响流式细胞术结果显示,与Vehicle组相比,当PA浓度上升到200 μmol·L-1时,细胞凋亡明显升高,当PA浓度达到250 μmol·L-1时,细胞凋亡接近50%(Fig 2)。

2.3 PA对GC-1细胞凋亡蛋白caspase-3活性的影响Fig 3结果表明,与Vehicle组相比,凋亡蛋白caspase-3的活性在PA处理后表现出浓度依赖性上升的趋势,当PA浓度上升到150 μmol·L-1时,差异具有统计学意义。

2.4 PA对GC-1细胞凋亡蛋白表达的影响Western blot结果表明,与Vehicle组相比,GC-1细胞在150、200、250 μmol·L-1PA处理后,BAX/BCL2及cleaved-caspase-3的表达明显上调,且呈浓度依赖性(Fig 4)。

Fig 1 Effect of PA on cell viability of GC-1 n=6)

Fig 2 Effect of PA on apoptosis rate of GC-1 n=3)

2.5 PA对GC-1细胞ERS信号通路相关蛋白GRP78、CHOP及caspase-12表达的影响Western blot结果表明,与Vehicle组相比,PA可诱导GC-1细胞ERS标志物蛋白GRP78以及ERS相关的凋亡标志物蛋白CHOP表达上调,ERS凋亡的关键蛋白cleaved-caspase-12/caspase-12比值上升(Fig 5)。

Fig 3 Effects of PA on activity of caspase-3

Fig 4 Effects of PA on expression of apoptosis pathway related proteins in GC-1 n=3)

2.6 PA对GC-1细胞PERK-eIF2α-ATF4及ATF6信号通路的影响Western blot结果表明,PA处理后,各组细胞PERK-eIF2α-ATF4信号通路蛋白p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α相较于Vehicle组无明显变化,ATF4在PA浓度上升至250 μmol·L-1时表达下调,ATF6信号通路蛋白ATF6的表达无显著变化(Fig 6)。

Fig 5 Effects of PA on expression levels of ERS pathway related proteins GRP78, CHOP and caspase-12 in GC-1 n=3)

2.7 PA对GC-1细胞IRE1-XBP1信号通路的影响Fig 7结果表明,与Vehicle组相比,PA处理诱导了GC-1细胞IRE1-XBP1信号通路蛋白p-IRE1/IRE1、XBP1(Fig 7)的表达明显上调。

3 讨论

肥胖通常伴随着脂肪酸代谢失调,包括血浆中饱和脂肪酸水平升高[7]。临床研究表明,膳食中PA的摄入量过多会引发弱精子症[8],提示PA在肥胖相关的男性不育中起重要作用。在睾丸组织中过量的PA会引起脂毒性引起细胞功能障碍,进而诱导细胞凋亡[9]。

PA可通过激活HepG2肝细胞[6]的ERS诱导细胞凋亡。本研究结果显示,随着PA浓度的升高,GC-1细胞凋亡蛋白caspase-3,活性上升、细胞凋亡率升高、凋亡蛋白cleaved caspase-3表达上调,BCL2表达下调。以上结果说明,PA处理诱导了GC-1细胞的凋亡。

研究发现,ERS与细胞凋亡直接相关,在ERS发生时,GRP78显著上调,并通过触发UPR进而导致促凋亡转录因子CHOP水平升高,诱导细胞凋亡[5]。在毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)诱导的PC12细胞[10]ERS模型中,GRP78与CHOP显著上调,细胞凋亡增多。本研究结果显示,PA处理48 h后,GRP78与CHOP表达均显著上调。以上结果表明,PA处理激活了GC-1细胞的ERS,这也许是PA诱导GC-1细胞凋亡可能的作用机制。因此,本研究随后探讨了ERS信号通路的变化情况。

ERS激活会触发UPR,GRP78与PERK、IRE1、ATF6解离,并通过以下3条不同的通路缓解ERS,PERK-eIF2α-ATF4是UPR中最经典的途径,当PERK与GRP78解离时会发生自磷酸化,从而使eIF2α失活,抑制大部分蛋白质的合成从而缓解ER压力,然而p-eIF2α可特异性上调ATF4的表达。在UPR早期,ATF4上调ER分子伴侣蛋白的转录表达以恢复ER稳态,而在长期的UPR状态下,ATF4可以与UPR元件结合,促进CHOP的表达,诱导ATP耗竭、氧化应激和细胞凋亡[11];IRE1-XBP1是UPR中最保守的途径,当IRE1与GRP78解离时会发生自磷酸化,IRE1可通过IRE1依赖的降解(RIDD)减少蛋白质的合成以缓解ER压力,然而长期的UPR状态下,p-IRE1可将XBP1剪切,剪切后的XBP1易位到细胞核中,上调CHOP的表达促进细胞凋亡[12];ATF6是UPR中很重要的一条途径,当ATF6与GRP78解离时会被高尔基体蛋白酶体剪切并激活,激活后的ATF6进入细胞核后可促进ER分子伴侣基因的转录,调节UPR以缓解ER压力。同时,ATF6也可以增强XBP1和CHOP的转录[13]。综上,在UPR早期,ATF4与ATF6的功能相似,均通过调控ER分子伴侣基因的转录以缓解ER压力,与之不同的是,IRE1则通过RIDD减少蛋白质的合成以缓解ER压力。而在长期的UPR状态下,三条通路则发挥着类似的作用,均可通过上调CHOP的表达促进细胞凋亡。

Fig 7 Effects of PA on expression levels of IRE1-XBP1 pathway related proteins in GC-1 n=3)

短时间(24 h)PA诱导的GC-1细胞凋亡模型中,GRP78、CHOP表达上升,PERK-eIF2α-ATF4信号通路以及IRE1-XBP1通路被激活,提示PA通过PERK-eIF2α-ATF4和IRE1-XBP1两条通路激活ERS,诱导GC-1细胞凋亡[14]。本研究结果与文献报道存在差异,ATF4变化的趋势不一致,可能是因为本研究中PA作用的时间过长(48 h)而导致的。

ATF4是哺乳动物应激反应的主要调节因子,包括ERS和线粒体应激等。ATF4可通过上调ER分子伴侣蛋白的转录表达以恢复ER稳态;同时,ATF4可通过激活综合应激反应(ISR)重新编程细胞代谢,通过减少线粒核糖体蛋白、抑制线粒体翻译维持线粒体蛋白稳态[15]。本研究结果显示,250 μmol·L-1PA处理48 h后,ATF4的蛋白表达水平显著下降,提示在该条件下,GC-1细胞无法通过ATF4维持细胞稳态。

IRE1与脂质代谢的调节直接相关[16],RIDD是脂质稳态的关键调控机制,IRE1可有效降低血浆脂质水平,同时IRE1可有效防止肝细胞内的脂质积累[17]。本研究结果显示,PA处理48 h后,IRE1-XBP1信号通路显著激活,提示在PA诱导的高脂条件下,细胞通过IRE1-XBP1信号通路调控脂质稳态。如前所述,当脂质长时间过度累积时,ERS被激活,进而触发UPR,细胞通过IRE1-XBP1信号通路促进CHOP表达诱导细胞凋亡。

综上所述,48 h PA处理诱导GC-1细胞凋亡,其诱导凋亡的机制可能与ERS相关,起主导作用的可能是IRE1-XBP1信号通路。