PMP柱前衍生HPLC法测定八月瓜果皮多糖中单糖组成

刘永玲，赵建国，赵治兵，刘向炼，刘元凤，李观龙，谢国芳

（1.贵阳学院 食品科学与工程学院，贵州 贵阳 550005；2.贵州省果品加工工程技术研究中心，贵州 贵阳 550005；3.华润雪花啤酒（黔南）有限公司，贵州 黔南 551200；4.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

八月瓜[Akebia trifoliate（Thunb.）Koidz]属木通科藤本植物，为药食两用资源，成熟的八月瓜沿腹线自然开裂，又称“野香蕉”、“八月炸”等。八月瓜果实营养丰富，其果实、种子、茎和根在中药中的应用已有至少2 000 年的历史[1]，有舒肝理气、活血止痛、除烦利尿和抗菌消炎等功效[2-3]，具有较高的经济价值和医学发展价值。随着八月瓜大量种植的推广，加之其深加工方式的局限性，其果皮成为一种副产物大量被丢弃而污染环境，因此从八月瓜果皮中探索其他活性物质具有重要的意义和价值。八月瓜果皮的研究多集中于果胶和皂苷类化合物[4-5]，越来越多的学者期望从果皮中探索其他活性成分，Luo 等[6]发现八月瓜果皮提取物具有很强的抗氧化活性，可为天然抗氧化剂的开发提供基础，Zhang 等[7]通过酸提法得到的三叶木通果皮提取物可用作一种新型环保、高效的缓蚀剂。针对八月瓜中多糖的研究仅限于总糖的测定，如李秀彤等[8]测得八月瓜鲜果中总糖含量为15.78%，相较于常见的16 种水果处于较高水平；张孟琴等[9]研究发现三叶木通果皮中总糖含量高达32.61%。目前，深入分析八月瓜果皮多糖中单糖组成的研究鲜见报道。

多糖作为天然药物资源中一种重要的活性物质，在抗氧化、抗病毒、抗凝血、降血糖和降血脂等方面具有显著功效[10-11]，研究其单糖组成、糖苷键类型及连接顺序等结构特征成为多糖开发利用的关键[12]。目前，常见的单糖检测方法有薄层色谱法、离子色谱法、气相色谱法和液相色谱法，但都存在一定的局限性，如薄层色谱法灵敏度低、分离度和重现性差，仅用于简单多糖的定性分析[13]；离子色谱法虽然灵敏度和分离度相对较高，但其使用的氢氧化钠易使糖类分解和异构化[14]；气相色谱法复杂的衍生化操作易产生副衍生物，造成多峰、重叠峰等现象[15]；液相色谱法可用示差检测器和蒸发光检测器，但其价格昂贵，其中示差检测器平衡时间较长，基线波动大[16]，不宜使用梯度洗脱条件[17]，蒸发光散射器对糖含量少的样品灵敏度低，对糖的分离和定量分析产生影响[18]。而衍生高效液相色谱法是通过柱前或柱后衍生，以提高无紫外或弱紫外吸收单糖的分离选择性和检测灵敏度，其中柱后衍生成本高、不常用，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生结合高效液相色谱法反应条件温和，不会导致立体异构，具有较高的检测灵敏度，比其他方法更具实用性[19-20]。

本研究采用柱前衍生高效液相色谱法建立八月瓜果皮多糖中6 种单糖含量的测定方法，通过主成分分析对贵州不同主产地八月瓜果皮多糖中的单糖进行差异分析，旨为八月瓜果皮的开发利用及果皮多糖的进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

10 批八月瓜样品分别采自贵州省不同产地，经贵阳学院杨碧仙教授鉴定为八月瓜[Akebia trifoliate（Thunb.）Koidz]的果实，于4 ℃采样箱运回贵州省果品加工工程技术研究中心实验室。挑选果皮颜色均一、炸裂开口度占比为整个果实2/3 的八月瓜果实采收，每批选取成熟果实10 个。果皮和果肉分离，果皮于-80 ℃超低温冰箱保存备用。样品信息见表1。

表1 八月瓜样品信息Table 1 Sample information of Akebia trifoliate

L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖对照品（纯度均≥98%）、透析袋[MD77-（8000-14000）]：北京索莱宝科技有限公司；D-甘露糖（纯度≥99%）：西亚化学科技（山东）有限公司；D-阿拉伯糖（纯度≥99%）：北京北方伟业计量技术研究院有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）、三氯乙酸（分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；甲酸铵（色谱纯）：上海麦克林生化科技有限公司；氢氧化钠、盐酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；氯仿、无水乙醇、丙酮（均为分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（LC-20A 型）、SHIMADZU-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：日本岛津公司；台式低速离心机（TD4 型）：湖南赫西仪器装备有限公司；旋转蒸发仪（RE-52A 型）：上海亚荣生化仪器厂；超声波清洗器（KQ-500 型）：昆山市超声仪器有限公司；匀浆机（JJ-2B 型）：金坛区西城新瑞仪器厂；打浆机（WBL-2501B 型）：广东美的生活电器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 对照品储备液的配制

精密称取L-鼠李糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-半乳糖醛酸对照品，分别置于5 mL 容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度线，混匀，配制D-甘露糖（1.624 mg/mL）、L-鼠李糖（2.000 mg/mL）、D-半乳糖醛酸（2.162 mg/mL）、D-葡萄糖（2.002 mg/mL）、D-半乳糖（1.886 mg/mL）、D-阿拉伯糖（1.890 mg/mL）的对照品储备液，放置4 ℃冰箱备用。准确吸取适量各对照品储备液至容量瓶中，甲醇定容，配制系列浓度的混合标准溶液，备用。

1.3.2 八月瓜果皮多糖的制备

1.3.2.1 样品处理

10 批贵州不同产地的八月瓜果皮用料理机打浆，匀浆机匀浆，分装于保鲜盒中备用。

1.3.2.2 八月瓜果皮多糖的提取

称取1.3.2.1 的八月瓜果皮浆适量，按料液比1 ∶20（g/mL）加入95%乙醇，于80 ℃下超声提取30 min，过滤后弃去滤液除去部分单糖，滤渣重复超声2 次。所得滤饼按料液比1 ∶20（g/mL）加入蒸馏水，90 ℃水浴1 h，趁热过滤，收集滤液，残渣重复上述操作2 次，合并滤液。将滤液浓缩至原体积的1/3 后采用Sevage 法[21]脱去蛋白，收集上清液并转移至透析袋中，将透析完的多糖溶液加入4 倍体积的无水乙醇使多糖沉淀，4 ℃静置过夜12 h，抽滤，依次用无水乙醇、丙酮各淋洗3次，真空冷冻干燥后即得八月瓜果皮多糖。

1.3.2.3 八月瓜果皮多糖的水解

称取八月瓜果皮多糖4.0 mg 于15 mL 具塞试管，加入2 mol/L 三氟乙酸溶液5 mL，氮气封口后于100 ℃水解6 h，取出后冷却至室温，70 ℃水浴蒸干，加入2 mL甲醇水浴蒸干，重复3 次以除尽多余的三氟乙酸，加3 mL 甲醇溶解，即得八月瓜果皮多糖水解液，备用。

1.3.2.4 对照品及样品溶液的衍生化

分别取1.3.1 的混合标准溶液、1.3.2.3 的八月瓜果皮多糖水解液0.5 mL 于刻度试管中，分别加入0.3 mol/L NaOH 溶液0.5 mL 混匀，加0.5 mol/L PMP-甲醇溶液0.5 mL，混匀后70 ℃水浴60 min，室温冷却后加入0.3 mol/L HCl 溶液0.5 mL 中和NaOH，加氯仿2 mL，充分萃取后弃去氯仿层，重复3 次以除去过量的PMP，上清液过0.45 μm 微孔膜备用。

1.3.3 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）检测条件

色谱条件：SHIMADZU-C18 色谱柱；乙腈（A）-0.05 mol/L 甲酸铵溶液（B）梯度洗脱（0～10 min：18%A；10～20 min：18%～20% A；20～40 min：20% ～23% A；40～60 min：23% A），检测波长254 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL，流速1 mL/min。分别对衍生后的对照品及八月瓜样品进行HPLC 分析，按标准曲线法计算样品中6 种单糖的含量及比例。

1.3.4 单糖含量的计算

将6 种单糖的峰面积均值带入相应的线性方程，计算出相应的浓度，按下列公式计算八月瓜果皮多糖中单糖。

式中：Wi为八月瓜果皮多糖样品中各单糖的含量，mg/g；Ai为各单糖的峰面积；a 为标准曲线的斜率；b 为标准曲线的截距；V 为样品溶液的体积，mL；m 为八月瓜多糖样品的质量，mg。

1.4 数据处理

使用SPSS 22.0、Microsoft Excel 2019、GraphPad Prism 7.0 等软件对数据和图像进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 标准曲线和线性范围

将1.3.1 单糖对照品储备液配制成混合标准溶液：含D-甘露糖50.50 μg/mL、L-鼠李糖50.00 μg/mL、D-半乳糖醛酸480.00 μg/mL、D-葡萄糖240.00 μg/mL、D-半乳糖100.00 μg/mL、D-阿拉伯糖104.00 μg/mL，对混合标准溶液进行等倍逐级稀释，分别按1.3.2.4 方法进行柱前衍生化HPLC 分析，选择线性范围合适的5 个混和标准溶液浓度；拟合峰面积（y）和进样浓度（x，μg/mL）作回归曲线，结果如表2 所示。

表2 6 种单糖的标准曲线及线性范围Table 2 Standard curves and linear ranges of six monosaccharides

由表2 可知，6 种单糖的相关系数R2均大于0.9980，线性关系良好。

2.1.2 稳定性试验结果

精密称取八月瓜果皮多糖4.5 mg，按照1.3.2 方法进行水解和衍生化，衍生样品于4 ℃保存，每隔2 h 进行HPLC 分析，共6 针，结果显示D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值依次为1.85%、2.21%、2.57%、1.62%、2.97%、2.88%，表明衍生化样品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.1.3 重复性试验结果

精密量取1.3.2.3 的八月瓜果皮多糖水解液0.5 mL于10 mL 具塞试管中，平行6 份，按照1.3.2.4 方法进行柱前衍生化HPLC 分析，记录峰面积值，计算得到D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖峰面积的RSD 值依次为2.14%、2.87%、2.33%、2.67%、2.56%、2.81%，说明该方法重复性良好。

2.1.4 精密度试验结果

精密量取1.3.1 的混合标准溶液0.5 mL 于10 mL具塞试管中，然后按照1.3.2.4 方法进行柱前衍生化HPLC 分析，重复进样6 次，计算6 次所得单糖峰面积的RSD 值，D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖面积的RSD 值依次为1.44%、0.97%、0.86%、1.52%、1.03%、1.37%，说明该方法精密度良好。

2.1.5 回收率试验结果

取3 份已知浓度的水解供试品溶液0.5 mL，每份平行3 次，分别加入0.5、1.0、1.5 倍质量浓度的混合标准溶液，按照1.3.2.4 方法进行柱前衍生化HPLC 分析，依据各单糖峰面积计算回收率，结果见表3。

表3 加标回收率测定结果Table 3 Determination results of spiked recovery

由表3 可知，八月瓜果皮多糖中6 种单糖的加标回收率为92.58%～100.02%，结果表明，该方法适用于八月瓜果皮多糖中D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖和D-阿拉伯糖含量的测定。

2.2 八月瓜果皮多糖样品组分分析

2.2.1 八月瓜果皮多糖水解物的衍生化HPLC 分析

八月瓜果皮多糖经衍生化处理，HPLC 检测，确定了八月瓜果皮多糖中含有6 种单糖成分，样品中各目标化合物均能实现基线分离，分离度良好。6 种单糖标准溶液的HPLC 色谱图见图1，八月瓜果皮多糖溶液的HPLC 色谱图见图2。

图1 6 种单糖标准溶液的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of mixed six monosaccharide standards

图2 八月瓜果皮多糖溶液的HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of the polysaccharide solution of Akebia trifoliate peel

2.2.2 八月瓜果皮多糖的单糖组成及含量结果

10 批贵州不同产地的八月瓜果皮按照1.3.2 和1.3.3 方法制备、进样分析，10 批样品多糖中单糖含量和物质的量比结果见表4 和表5。

表4 10 批贵州不同产地八月瓜果皮多糖中6 种单糖含量Table 4 Content of 6 monosaccharides of Akebia trifoliate peel polysaccharides in 10 batches from different regions in Guizhou mg/g

表5 八月瓜果皮多糖中单糖物质的量比（n=3）Table 5 Molar ratio of monosaccharides in Akebia trifoliate peel polysaccharides（n=3）

由表4 和表5 可知，10 批八月瓜果皮多糖中均含有D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖，其含量分别为2.21～11.23、1.67～12.42、51.84～212.84、22.44～73.23、4.85～30.30、6.14～60.01 mg/g，各单糖组分含量存在明显差异，其中D-半乳糖醛酸含量最高，D-葡萄糖次之。6 种单糖组分平均物质的量比为D-甘露糖∶L-鼠李糖∶D-半乳糖醛酸∶D-葡萄糖∶D-半乳糖∶D-阿拉伯糖=1.18 ∶1.00 ∶23.25 ∶11.73 ∶3.51 ∶5.88。

续表5 八月瓜果皮多糖中单糖物质的量比（n=3）Continue table 5 Molar ratio of monosaccharides in Akebia trifoliate peel polysaccharides（n=3）

2.2.3 主成分分析

将10 批样品中的D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖和D-阿拉伯糖的含量作为提取特征，导入SPSS 22.0 统计软件进行主成分分析，结果如表6 和表7 所示。

表6 特征值及累计方差贡献率Table 6 Eigenvalue and cumulative variance contribution rate

表7 主成分载荷矩阵Table 7 Load matrix of principal components

由表6、表7 可知，从八月瓜果皮多糖的6 个单糖组分中提取出了2 个特征值大于1 的主成分，前两个主成分累计方差贡献率为86.463%，成分1 主要反映D-半乳糖醛酸、D-甘露糖和D-阿拉伯糖含量为主要影响因子，成分2 主要反映D-葡萄糖含量为主要影响因子。

样品主成分得分、综合得分及其排序见表8。

表8 样品主成分得分、综合得分及其排序Table 8 Scores，comprehensive scores，and ranking of principal components

由表8 可知，相对于主成分1 产地为安顺（Q2）的八月瓜多糖得分最高，相对于主成分2 产地为黔西谷里（Q9）的八月瓜多糖得分最高，综合得分排序由高到低依次为Q2、Q7、Q6、Q3、Q8、Q1、Q5、Q10、Q9、Q4，且单糖综合排序为正值的代表性样品Q2、Q7、Q6、Q3 的产地位于贵州省东南方向，这可能是因为糖分的积累与产地的日照、昼夜温差等因素有关。

3 结论

本研究建立柱前衍生HPLC 法同时测定了八月瓜果皮多糖中D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖和D-阿拉伯糖的含量，并对贵州省10 批不同产地的八月瓜样品检测分析，确定单糖成分及其物质的量比。经方法学验证，所建立的柱前衍生HPLC 方法可靠、适用性强，适用于八月瓜果皮多糖中6 种单糖的定性和定量分析。经HPLC 检测10 批样品中均含有6 种待测单糖，各单糖含量及组成比例有明显差异，6 种单糖组分平均物质的量比为D-甘露糖∶L-鼠李糖∶D-半乳糖醛酸∶D-葡萄糖∶D-半乳糖∶D-阿拉伯糖=1.18 ∶1.00 ∶23.25 ∶11.73 ∶3.51 ∶5.88。10 批样品经主成分分析发现D-半乳糖醛酸和D-葡萄糖含量明显高于其他4 种单糖，主成分得分经排序发现安顺（Q2）、长顺（Q7）、铜仁（Q6）和麻江（Q3）产地的单糖综合排序为正值，这些产地基本位于贵州省的东南方向，推测主成分的含量与产地的气候环境有相关性。后期研究中，将对不同产地八月瓜果皮单糖组分在果实发育过程中的积累变化进行进一步研究，考察糖分的积累是否与产地不同而有不同的趋势。