医疗器械无菌检查检验结果偏差的调查与分析

缪剑虹 孔怡然 刘尧 深圳市药品检验研究院 （广东 深圳 518057）

内容提要： 目的：对无菌医疗器械的无菌检验结果开展全过程的回顾性调查与分析，以探讨无菌检验检验结果偏差（OOS）发生的原因，并规定了OOS结果调查的具体操作规程。方法：根据《中华人民共和国药典》（2020版）和新版药品生产质量管理规范标准的OOS指南，从人、机、料、法、环、测六要素进行深入分析和探讨，找出无菌检验过程中可能导致微生物污染的原因。结果：通过OOS结果调查分析，排除了实验室环境和检验人员操作导致样本污染的情况，初步分析在试验样本中检出的微生物为产品本身的缺陷，可能是产品终端灭菌不彻底，细菌芽孢未被完全杀灭导致的产品缺陷。结论：OOS调查过程可以帮助实验室识别导致OOS结果的可能原因，然后采取纠正和预防措施。在微生物实验室建立完善的OOS结果调查计划以规范调查操作流程，是提高微生物实验室质量管理水平的重要手段。

医疗器械无菌检查是无菌提供的医疗器械质量控制的重要部分之一，也是提升无菌医疗器械质量控制水平、控制医疗器械临床不良反应发生率的主要措施。无菌医疗器械如果被微生物污染，有可能引起患者的感染，以至危及患者的生命安全[1]。微生物普遍存在于自然环境中，检验人员的活动、检验仪器及产品包装等都可能把这些微生物引入检验环境中，进而导致假阳性结果。检验结果偏差（Out of Specification，OOS）结果是指不符合所依据的质量标准中规定的可接受的检验结果，其对应的实验室检验结果不满足有关规定以及不符合相关标准要求。OOS结果调查是实验室质量体系关键要素之一，《中华人民共和国药典》（2020版）和现行动态药品生产管理规范法规对微生物检测OOS结果的调查作出了更详细的阐述和应用研究[2]。还规定实验室对OOS结果应当依据书面程序开展全面调查，力求找出导致OOS结果的主要原因并判断其是否有效，以保证检测结果的准确性。为保证其意义，OOS结果调查应该是完全的、及时的、不带有任何偏见的、记录是完整且经得起科学推敲的[3]。

基于微生物检测结果固有的变异性，无菌检验OOS结果调查相较于其他理化检验项目，在调查的工作量、专业性以及复杂程度都有更高的要求。因此，为规范OOS调查流程，实验室不仅需要具备受过专业培训和丰富检验经验的专业技术人员，还需要建立完善的OOS结果调查程序。对于微生物实验室OOS结果的调查，需要核实的相关记录和影响因素非常繁杂，由于其复杂性，OOS结果的调查必须更加严谨，并尽量回顾实验过程中的每一个环节。OOS结果调查分为实验室初步调查、全面OOS结果调查、调查结论等三部分内容[4]。本文将结合实验室的实际情况对某次无菌检查发现的OOS结果进行调查和分析。

1.资料与方法

1.1 一般资料

调查时间为2022年7月25日～2022年8月2日。实验室检验人员系有5年以上微生物检验经验的资深检验员，取得了微生物检查和无菌检查的岗位授权。4批无菌医疗器械，其中注射器和棉签为监督抽验样品，医用外科口罩和医用防护口罩为评价性抽验样品。

仪器设备：恒温培养箱，低温培养箱，全自动革兰氏染色仪，显微镜，BD全自动细菌鉴定/药敏系统。

1.2 方法

实验室检验人员对4批无菌医疗器械进行无菌检查，其中有一批棉签的检验结果呈阳性，用一次性无菌接种环取上述阳性培养物经胰酪大豆胨琼脂培养基划线分离，置33°C培养箱培养24～48h，挑取单个菌落经胰酪大豆胨琼脂培养基纯化，置33°C培养箱培养24～48h，最终得到2株细菌，使用BD全自动细菌鉴定/药敏系统进行微生物鉴定[5]。

2.结果

4批无菌医疗器械的无菌检查结果如表1所示：其中，棉签样品的胰酪大豆胨液体培养基管均在第4天变浑浊。取浑浊的胰酪大豆胨液体培养液划线胰酪大豆胨琼脂平板，33°C培养48h，得到2株不同菌落形态的菌株[6]。

革兰氏染色镜检结果均为革兰氏阳性芽孢杆菌，经BD全自动细菌鉴定/药敏系统鉴定，全自动生化鉴定结果分别为环状芽孢杆菌（Baci.circulans）、短小芽孢杆菌（Baci.pumilis）。

3.讨论

3.1 OOS结果的调查和分析

一旦OOS结果被确定，实验室应客观地和及时地进行评估，不应该对OOS结果的原因进行预想的假定，应该迅速评估数据以确定结果是否属于实验室错误，或该结果是否显示是产品缺陷的问题，在调查的过程中，每一步的调查都应做充分的记录。下面将结合微生物实验室的实际情况，按照《中华人民共和国药典》（2020版）和现行药品生产质量管理规范标准的要求，对此次医疗器械的无菌检验过程中涉及的各方面要素进行回顾和检查[7-10]。

3.1.1 相关人员资质

试验人员具备专业的微生物检验能力，有无菌检验的岗位授权，熟悉无菌检验的操作流程和监控要点，持续参加微生物相关专业的内外部培训，定期参与微生物相关的能力验证。洁净室清洁人员接受过专业的洁净室清洁培训，并取得相关岗位授权。

3.1.2 试验样品、器具和培养基

样品内外包装完整无损，外观无异常，样品在无菌实验前均进行了表面消毒。实验用培养基的无菌实验结果均符合规定，实验用器具经过严格的灭菌处理，上述器具和试剂用于同日检查的其他检品，同时检测的其他3批检品无菌检查结果均符合要求，未发现实验室污染的情况。

3.1.3 设施环境

无菌检查室定期安排专业人员进行清洁和消毒，洁净区室定期做环境监测，检测当天使用的超净工作台的沉降菌以及手套和操作服的表面微生物，未收集到相关环境微生物，在目前为止，环境监测收集到的微生物中，未检测出环状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。

3.1.4 仪器设备

试验使用的仪器设备在性能确认有效周期内，并处于正常使用状态，灭菌参数设置和培养箱温度设置正确，灭菌效果核查正常，上述设备同时用于同日检查的其他检品，未发现污染的情况。

3.1.5 培养基试剂耗材

无菌检查使用的培养基均通过培养基适用性检查，培养基试剂耗材均处于有效期内，外观形状无异常，保存条件符合要求。

3.1.6 标准物质

检查当天试验所用的标准物质名称、批号是否正确，标准物质可溯源，外观形状无异常，储存条件符合要求，标准物质溶液配制正确且在使用有效期内。

3.1.7 检验操作过程

供试品取样均匀且有代表性，取样量已满足标准要求，供试品溶液配制正确，当天检测所用的容量仪器均检定合格并在有效期内，已按要求进行空白试验且空白试验符合要求。

3.1.8 污染微生物分析

试验样品中检出的2株菌株分别为环状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌，在日常环境监测的过程中从未在实验室环境中及检测人员的手套和操作服上检测到这两种菌，因此，排除污染微生物是由实验室环境或检测人员操作带入污染的可能。

3.2 分析与小结

通过以上OOS结果调查分析，未发现明显的实验室缺陷。经实验室初步分析导致无菌检查结果不合格的原因可能是产品终端灭菌不彻底，细菌芽孢未被完全杀灭而导致的产品质量缺陷。芽孢杆菌，细菌的一科，能形成芽孢（内生孢子）的杆菌，它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。芽孢抗逆性很强，如果灭菌不彻底，没有被杀灭的芽孢会再次萌发，从而造成灭菌失败[11]。

通过对上述OOS结果的调查和分析，初步建立了微生物实验室OOS结果调查的分析方案，分别从如下多个角度加以说明：

3.2.1 人员

人员包括检验人员和实验室清洁人员，检验人员是否熟悉相关检测方法、程序、检测目的和结果评价方法，是否持续接受微生物相关专业的培训，且能够独立从事该项无菌检查试验。实验室清洁人员是否经过相关的培训和授权，检查实验室清洁消毒记录是否做到定期的清洁与消毒。

3.2.2 培养基/试剂/耗材

检查培养基是否按照标准程序完成验收，并查看培养基的配制、灭菌和储存情况，确保培养基的配制和灭菌有效，培养基和浸提介质的阴性对照应符合规定。所使用的器具是否经过消毒灭菌，一次性使用耗材是否经过质量验收，确保其满足实验的标准要求。

3.2.3 样品

样品名称，样品编号及批号是否正确，样品外观有无异常，内外包装是否完整无损，样品存储是否符合要求，如有同时检测的其他样品的无菌检查情况。

3.2.4 设施设备

洁净区是否定期清洁消毒，定期做环境监控，检查实验当天洁净室的温湿度和压差是否在标准规定范围内，是否按规定检测当天的表面微生物和工作台沉降细菌。仪器的计量或校准是否在周期内，核查灭菌设备灭菌效果，检查灭菌参数和培养温度是否设置正确，检查涉及的仪器设备的日常维护和保养记录。

3.2.5 检验用标准

检验用标准是否使用正确，检验方法是否经过确认/验证。

3.2.6 检验检测过程

检验操作过程中供试品的取样是否均匀、有代表性，供试品取样量是否满足标准的要求，供试品溶液是否配制正确，其过滤性和稳定性是否满足要求；是否已按要求进行空白试验，检验过程中所用的容量仪器确保检定合格并在有效期内；检验人员是否严格按照规定的标准操作规程进行实验。

3.2.7 其他

此外，对检测过程中培养出的微生物进行菌种鉴定是无菌检查实验OOS调查的关键步骤，决定最后是否能够找到根本原因[12-15]。实验室应建立洁净区环境微生物信息库，环境菌的收集包括定期环境监测检测到的空气微生物、设施设备的表面微生物及每次实验过程收集到的无菌操作服和无菌手套的表面微生物。当检测出现阳性结果时，可将阳性检出菌与环境微生物信息库对比分析，以判断检出菌是否为实验室环境中带入导致的污染。

由于微生物分布的不均匀性，以及微生物的数量会因生长和环境等因素发生变化，微生物检测通常不允许进行复试，因此，实验室发生OOS结果时，及时有效地对OOS结果进行调查和分析，尽可能地找出导致不合格结果的真正原因，这是实验室质量管理体系中非常关键的环节[16,17]。需要注意的是，由于不同单位的技术水平和资源的局限，以及人类对微生物掌握的局限，不是每次的OOS结果调查都可以发现其根本原因，但通过OOS结果调查的过程能够帮助实验室找出导致OOS结果发生的可能原因，进而采取纠正预防措施。