秸秆还田配施氮肥对水稻根际土酶活性的影响

2023-11-09陈佩罗佳琳黄丽颖王宁于建光薛利红

农业环境科学学报 2023年10期

陈佩，罗佳琳，黄丽颖，4，王宁，3*，于建光，3，薛利红，3

（1.江苏省农业科学院农业资源与环境研究所/农业农村部长江下游平原农业环境重点实验室，南京 210014；2.济南大学水利与环境学院，济南 250022；3.江苏大学环境与安全工程学院，江苏镇江 212001；4.苏州农业职业技术学院，江苏苏州 215000）

土壤酶在稻田生态系统的物质循环和能量转化中起着非常重要的作用，它催化着土壤中的一切生物化学反应，反映了土壤中各种生物化学过程的强度和方向[1-4]。已有研究发现，脱氢酶属于胞内酶，能催化有机物质脱氢，起氢的中间转化传递作用，因此脱氢酶活性可以作为微生物氧化还原系统的指标，被认为能很好地表征土壤中微生物的氧化能力[5]。而土壤蛋白酶和脲酶与土壤供氮能力有密切关系，其酶活性的高低在一定程度上能够表征土壤氮素的供应程度[6-7]。此外，硝酸还原酶、亚硝酸还原酶以及羟胺还原酶活性作为土壤反硝化过程中的关键酶，是影响土壤反硝化过程及温室气体N2O 产出的重要因子之一[8-9]。因此，稻田土壤酶活性大小是土壤肥力的重要标志。

已有研究表明氮肥是影响土壤酶活性的重要因素之一。夏雪等[10]研究发现，低量（60 kg·hm-2）和中量（120 kg·hm-2）氮肥能够提高蔗糖酶和脲酶活性，而中量（120 kg·hm-2）和高量（240 kg·hm-2）氮肥可以增加碱性磷酸酶活性。由于土壤酶活性受到多种因素影响，如土壤物理性质、土壤养分、土壤微生物、人为因素以及植物根系等，目前关于氮肥施用对稻田土壤酶活性影响的认识并无统一结论[11-12]。秸秆还田作为秸秆利用的重要方式，可平衡土壤养分、改良土壤结构并有效抑制土传病害的发生，对于优化农田生态环境、促进作物增产及发展可持续农业具有重要意义[13-14]。然而，秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素三大部分组成，C/N 一般为60～80，大量的秸秆还田会造成土壤较高的C/N，降低土壤氮素有效性，抑制土壤酶活性，使秸秆在土壤中难以被微生物分解[15-16]。因此，秸秆还田条件下，如何合理施用氮肥是保证土壤全期肥力的关键问题。已有研究表明，与秸秆单独施用相比，秸秆还田配施化肥可显著提高稻田土壤过氧化氢酶、脲酶、转化酶活性[17]。而水稻根际是水稻-土壤-微生物相互作用的热点区域，土壤酶是其关键的中间介质[10-18]。因受作物根系影响，与非根际土壤相比，根际土壤生物化学活性通常更高[19]。然而，目前关于水稻根际区土壤酶活性对秸秆还田与氮肥配施的响应规律仍不够清晰。

因此，本试验拟选取两种典型稻麦轮作土壤作为研究对象，基于盆栽试验，以单施秸秆为对照，结合根际袋法，研究水稻根际和非根际区土壤酶活性对秸秆还田与氮肥配施的响应，探讨其如何影响土壤酶活性变化，从而为农田秸秆还田与氮肥配施提供必要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试土壤分别采自江苏省泰州市姜堰区（TZ）和江苏省常州市金坛区（CZ）的稻麦轮作田，其中江苏泰州土壤母质发育于河流沉积物，属于高砂土，而江苏常州土壤是黄泥土，发育于湖泊沉积物。取表层0～20 cm 土壤，室内风干、过筛后备用。供试土壤TZ和CZ的养分含量见表1。

表1 水稻土基本性质Table 1 Soil properties for the used two types of paddy soils

供试秸秆为小麦秸秆，收集于江苏省农业科学院小麦试验基地。麦秸含碳、氮量分别为475.0、4.9 g·kg-1，其碳氮比为96.9。将已粉碎的小麦秸秆以质量比1%的比例加入到已准备的两种类型稻麦轮作土壤中，混匀备用。

1.2 试验设计

称取1.50 kg 含1%秸秆的风干土壤装入网孔直径为30 µm 的根际袋（10 cm×30 cm）内，将根际袋置于试验桶（直径25 cm、高30 cm 的塑料圆桶）内，同时根际袋外也装入1.50 kg 含1%秸秆的风干土壤。供试水稻Oryza sativa品种为“南梗46”，将人工气候室内培育约1周的水稻幼苗移栽至根际袋中，每袋1株。试验设置3 个氮肥施用模式：①秸秆单独还田且不施加氮肥（S，对照）；②秸秆还田且施加常规氮肥（125 mg·kg-1，以N 计，相当于300 kg·hm-2）（SN）；③秸秆还田且施加高量氮肥（250 mg·kg-1，以N 计，相当于600 kg·hm-2）（SHN）。每个处理3 个重复，2 种类型土壤，共18个处理。氮肥分基肥、蘖肥、穗肥3次施入，施用比例为4∶3∶3，磷肥和钾肥作为基肥一次性施入，施用量分别为P2O590 mg·kg-1（相当于216 kg·hm-2），K2O 180 mg·kg-1（相当于432 kg·hm-2）。水稻生长过程中适时灌水保持淹水2 cm 左右，待水稻生长至成熟期后，破坏性采样收集根际土和非根际土，其中根际袋内的土壤混合均匀后作为根际土，根际袋外土壤混合均匀后作为非根际土。采集的土壤风干、研磨、过2 mm筛后用于土壤酶活性的测定与分析。

1.3 土壤酶活性测定

脱氢酶活性采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）还原法测定[20]，以24 h后1 g土壤中三苯基甲臢（TPF）的质量（µg）表示脱氢酶活性；蛋白酶活性采用酪蛋白酸钠分析法测定[20]，以1 g 土壤中氨基酸的质量（mg）表示蛋白酶活性；脲酶活性采用苯酚-次氯酸钠比色法测定[6]，以1 g 土壤中水解生成NH3-N 的质量（mg）表示脲酶活性；硝酸还原酶活性采用酚二磺酸比色法测定[6]，以24 h 后1 g 土壤中被还原的NO-3的质量（µg）表示硝酸还原酶活性；亚硝酸还原酶活性采用甲萘胺比色法测定[6]，以24 h后1 g土壤中被还原的NO-2的质量（mg）表示亚硝酸还原酶活性；羟胺还原酶活性参照关松荫[6]的方法测定，以1 h 后1 g 土壤中被还原的羟胺的质量（mg）表示羟胺还原酶活性。

1.4 数据分析

所有试验数据用Excel 2008 录入和整理，采用SPSS 22.0（IBM，美国）进行方差计算和相关性分析，采用R（2.14.0）软件进行主成分分析和方差分解分析，采用Duncan新复极差法进行处理间的多重比较和显著性检验（P＜0.05），图形绘制采用SigmaPlot 10.0。

2 结果与分析

2.1 水稻根际和非根际区土壤脱氢酶活性

不同处理下两种类型稻田根际和非根际区土壤脱氢酶活性见图1。由图1 可知，与非根际区土壤相比，3 种处理下两种类型稻田根际区脱氢酶活性显著提高了22.4%～48.7%（P＜0.05）。随着氮肥施用量的增加，江苏泰州非根际区土壤脱氢酶活性从17.0µg·g-1·d-1逐渐增加到20.0µg·g-1·d-1和23.0µg·g-1·d-1，根际区土壤脱氢酶活性从21.0µg·g-1·d-1逐渐增加到29.5µg·g-1·d-1和34.2µg·g-1·d-1（P＜0.05）。对于江苏常州稻田，非根际区土壤脱氢酶活性从19.3µg·g-1·d-1逐渐增加到22.0µg·g-1·d-1和25.2µg·g-1·d-1，根际区土壤脱氢酶活性从23.6µg·g-1·d-1逐渐增加到29.0µg·g-1·d-1和34.9µg·g-1·d-1。以上研究结果表明，随着氮肥施用量的增加，两种类型稻田根际区和非根际区土壤脱氢酶活性逐渐增大，而且根际区土壤脱氢酶活性显著高于非根际区。

图1 秸秆还田配施氮肥对两种类型稻田非根际和根际区土壤脱氢酶活性的影响Figure 1 Effects of straw return with different amounts of nitrogen fertilizer addition on the dehydrogenase activities in non-rhizosphere and rhizosphere of rice from both paddy soils

2.2 土壤蛋白酶和脲酶活性

土壤蛋白酶可以水解蛋白质为短肽，并将短肽进一步水解为氨基酸，这些水解产物是植物的氮源之一。不同处理下两种类型稻田根际和非根际区土壤蛋白酶活性见图2。由图2a可知，与非根际区土壤相比，SN 和SHN 处理下江苏泰州稻田土根际区蛋白酶活性分别显著提高了44.7%和34.2%（P＜0.05），而S处理下根际区蛋白酶活性虽有所增加，但效应并不显著（P＞0.05）；而对于江苏常州稻田土，与非根际区土壤相比，3 种处理中仅有SN 处理下水稻根际区蛋白酶活性显著提高了49.3%（P＜0.05），S 和SHN 处理则并未显著增加根际区蛋白酶活性（图2b）。研究还发现，随着氮肥施用量的增加，江苏泰州稻田非根际区蛋白酶活性从5.87 mg·g-1逐渐增加到6.20 mg·g-1和7.11 mg·g-1，但增加效应并不显著（P＞0.05）；根际区蛋白酶活性SN 和SHN 处理较S处理分别显著增加了36.1%和44.8%。对于江苏常州土壤，与S 处理相比，SN处理显著降低了水稻非根际区蛋白酶活性27.0%，但并未改变根际区蛋白酶活性；而SHN 处理显著提高了水稻非根际区和根际区蛋白酶活性83.9%～90.2%。以上研究结果表明，与非根际土壤相比，秸秆还田配施氮肥显著提高了江苏泰州根际土壤蛋白酶活性；对于江苏常州稻田，与非根际土壤相比，仅秸秆还田与常规氮肥配施显著提高了水稻根际土壤蛋白酶活性，而高量氮肥施用条件下根际和非根际区土壤蛋白酶活性并无显著性差异。

图2 秸秆还田配施氮肥对两种类型稻田非根际和根际区土壤蛋白酶和脲酶活性的影响Figure 2 Effects of straw return with different amounts of nitrogen fertilizer addition on the activities of protease and urease in nonrhizosphere and rhizosphere of rice from both paddy soils

土壤脲酶可以催化尿素释放氨以供作物吸收利用。由图2c 和图2d 可知，与非根际区土壤相比，3 种处理下两种类型稻田根际区脲酶活性提高了13.4%～70.9%，仅江苏常州S 处理根际土壤脲酶活性增加效应不显著。随着氮肥施用量的增加，江苏泰州非根际区土壤脲酶活性从0.14 mg·g-1逐渐增加到0.17 mg·g-1和0.19 mg·g-1；根际土脲酶活性从0.17 mg·g-1逐渐增加到0.21 mg·g-1和0.26 mg·g-1。对于江苏常州稻田，随着氮肥施用量的增加，非根际土壤脲酶活性并无显著性变化，约0.18～0.19 mg·g-1，而根际土脲酶活性从0.22 mg·g-1逐渐增加到0.26 mg·g-1和0.31 mg·g-1。以上研究结果表明，随着氮肥施用量的增加，江苏泰州根际区和非根际区以及江苏常州根际区土壤脲酶活性均逐渐增大。此外，两种类型稻田根际区土壤脲酶活性显著高于非根际土壤。

2.3 土壤反硝化酶活性

硝酸还原酶是硝酸盐次第还原过程第一步反应的限速酶，通常在缺氧、厌氧环境中启动，催化硝酸盐（）还原为亚硝酸盐（）。不同处理下两种类型稻田根际和非根际区土壤硝酸还原酶活性见图3a 和图3b。由图3a 和3b 可知，3 种处理下，与非根际区土壤相比，S 和SN 处理下江苏泰州根际土壤硝酸还原酶活性虽有所降低，但并不显著；而SHN 处理下江苏泰州根际土壤硝酸还原酶活性显著降低了32.3%。类似地，S 处理下江苏常州根际土壤硝酸还原酶活性也显著低于非根际区，酶活性降低了48.5%，而SN 和SHN 处理下根际土壤硝酸还原酶活性分别显著提高了243.8%和270.5%。随着氮肥施用量的增加，江苏泰州稻田非根际区硝酸还原酶活性呈现增加的趋势，其中SHN 处理显著增加了88.2%，而根际区硝酸还原酶活性并没有显著性变化；对于江苏常州稻田，SN 和SHN 处理下非根际区硝酸还原酶活性显著降低了63.4%和67.2%，而根际区硝酸还原酶活性显著增加了145.0%和134.0%。以上研究结果表明，随着氮肥施用量的增加，江苏泰州稻田非根际区土壤硝酸还原酶活性逐渐增加，而根际区硝酸还原酶活性并无显著性变化，因此，秸秆还田与高量氮肥配施条件下江苏泰州稻田根际区土壤脲酶活性显著低于非根际区。而对于江苏常州土壤，秸秆还田与氮肥配施下稻田根际区土壤硝酸还原酶活性显著高于非根际区。

图3 秸秆还田配施氮肥对两种类型稻田非根际和根际区土壤反硝化酶活性的影响Figure 3 Effects of straw return with different amounts of nitrogen fertilizer addition on the activities of denitrifying enzyme in non-rhizosphere and rhizosphere of rice from both paddy soils

亚硝酸还原酶是土壤系统中将反硝化中间产物NO-2还原成一氧化氮（NO）的关键酶。不同处理下两种类型稻田根际和非根际区土壤亚硝酸还原酶活性见图3c 和图3d。由图3c 可知，与非根际土壤相比，S处理并未显著改变江苏泰州稻田根际土壤亚硝酸还原酶活性；随着氮肥施用量的增加，江苏泰州稻田非根际区土壤亚硝酸还原酶活性从25.0 mg·g-1·d-1逐渐降低到18.0 mg·g-1·d-1和13.6 mg·g-1·d-1，而根际区土壤亚硝酸还原酶活性无显著变化，为25.2～26.9 mg·g-1·d-1。然而，对于江苏常州稻田，各处理条件下根际与非根际区土壤亚硝酸还原酶活性之间均无显著性差异，维持在23.5～30.6 mg·g-1·d-1；同时，随着氮肥施用量的增加，根际/非根际区土壤亚硝酸还原酶活性也无显著变化（图3d）。以上研究结果表明，秸秆还田条件下，无论氮肥施用与否，江苏常州稻田根际区与非根际区亚硝酸还原酶活性之间并不显著性差异。类似地，与非根际土壤相比，秸秆直接还田并未改变江苏泰州稻田根际区土壤亚硝酸还原酶活性，而秸秆与氮肥配施条件下，江苏泰州根际区土壤亚硝酸还原酶活性显著高于非根际区。

羟胺还原酶是将土壤中氮代谢（NO-3的异化反硝化或者氨的氧化）过程中形成的中间产物羟胺还原成氨的过程，因此，土壤羟胺还原酶活性的强弱影响到土壤氮代谢过程中氮素的氨挥发损失以及温室气体的排放。不同处理下两种类型稻田根际和非根际区土壤羟胺还原酶活性见图3e 和图3f。由图3e 可知，与非根际区土壤相比，3 种处理下两种类型稻田根际区羟胺还原酶活性显著提高了12.4%～23.0%（P＜0.05）；随着氮肥施用量的增加，江苏泰州非根际区土壤羟胺还原酶活性逐渐增加，其中SHN 处理显著增加了8.3%；根际区土壤羟胺还原酶活性显著增加了9.9%～18.0%（P＜0.05）。对于江苏常州稻田，与S处理相比，SN处理非根际区土壤羟胺还原酶活性显著增加了4.0%，SHN处理显著增加了11.6%（P＜0.05）；根际区土壤羟胺还原酶活性显著增加了6.3%～13.6%（P＜0.05）（图3f）。以上研究结果表明，随着氮肥施用量的增加，两种类型稻田根际区/非根际区土壤羟胺还原酶活性均逐渐增大，而且根际区土壤羟胺还原酶活性显著高于非根际区。

2.4 土壤酶活性的变化

为了进一步表征土壤6 种类型酶活性的变化，基于主成分分析（PCoA）显示，土壤酶活性在两种类型土壤之间、根际与非根际区土壤之间以及氮肥施用与未施用处理之间都存在一定程度的差异性（图4a～图4c）。此外，氮肥施用也显著改变了非根际/根际区土壤酶活性（图4d和图4e）。

图4 秸秆还田与不同量氮肥配施条件下两种类型稻田非根际和根际土壤酶活性的主成分分析Figure 4 Principal Components Analysis（PCoA）in non-rhizosphere and rhizosphere of both paddy soils with the application of straw return and different amounts of nitrogen fertilizer

方差分解分析（VPA）显示，土壤类型（TZvsCZ）、根际效应（根际区vs非根际区）以及施氮效应（氮肥施用vs未施用）3 种因素共解释了土壤酶活性变异量的63.5%，其分别单独解释了土壤酶活性变异量的9.9%、32.8%、20.8%（图5a）。同时，根际效应、施氮效应与土壤酶活性的相关性分析显示，根际效应与土壤脱氢酶、蛋白酶、脲酶、羟胺还原酶活性显著正相关，而施氮效应除与以上酶活性呈显著正相关外，还与土壤硝酸还原酶活性显著负相关（图5b）。

图5 土壤类型、根际与施氮效应对土壤酶活性变异的解释量及根际效应、氮肥施用与土壤酶活性的相关性Figure 5 Explaining proportion of soil type，rhizosphere and nitrogen fertilizer on the change of soil enzyme activity and correlation analysis among rhizosphere，nitrogen fertilizer and soil enzyme activities

3 讨论

3.1 氮肥施用对稻田土壤酶活性的影响

氮素是作物生长和微生物繁殖必需的养分元素，水稻-土壤系统中水稻与微生物对氮素具有竞争关系，同时微生物也能够通过分泌碳氮转化相关的酶来分解土壤有机质中的氮素，从而实现对氮素的反调控，达到土壤微生态物质平衡，满足水稻、微生物生长的计量学需求，因而氮肥施用是导致土壤酶活性变化的重要因素[21-22]。本研究发现，氮肥施用对土壤酶活性变异的解释量达到20.8%。氮肥施用显著改变了根际和非根际区土壤酶活性，而且显著提高了两种类型土壤非根际区和根际区脱氢酶和羟胺还原酶活性、江苏泰州非根际区和根际区土壤脲酶活性，以及江苏常州非根际区和根际区土壤蛋白酶活性（高量氮肥施用条件下）。同时，氮肥效应与土壤脱氢酶、蛋白酶、脲酶和羟胺还原酶活性呈显著的正相关性，这很可能是由于氮肥施用可刺激土壤微生物生长，进而分泌更多的土壤酶，提高了土壤微生物活性[23]。

然而，非根际与根际区土壤酶活性对氮肥施用响应存在显著性差异。已有研究表明，非根际区土壤酶活性主要受到土壤微生物的影响，根际区土壤酶活性除了受土壤微生物的影响外，还与根系分泌物及作物生长密切相关[24-25]。针对江苏泰州根际土壤，本研究发现，与未施用氮肥土壤相比，氮肥施用显著提高了根际土壤蛋白酶活性。这很可能是由于根际区氮需求比较高，氮肥施用条件下土壤蛋白酶分泌的增加，可促进分解土壤有机质中的氮素，满足根际区作物和微生物的需要。与根际土壤不同，非根际区需氮量较少，无需更多蛋白酶来提高土壤氮含量，因此，氮肥施用下江苏泰州非根际区土壤蛋白酶活性并无显著性变化。然而，根际区土壤氮素可能主要供水稻吸收利用，而对反硝化菌生长并无显著影响，因而，氮肥施用条件下，硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性在根际土壤中并无显著变化，而非根际区氮肥施用下脲酶活性的提高为土壤硝酸还原菌提供了氮源，进而提高了非根际区硝酸还原酶活性。

非根际与根际区土壤酶活性对氮肥施用响应的差异性也与土壤类型密切相关。与江苏泰州土壤不同，江苏常州土壤含氮量比较高，很可能满足了非根际区土壤微生物生长的需求。因此，氮肥施用下非根际土壤区中脲酶活性并无显著性变化。同时，江苏常州土壤较高的含氮量，不仅满足了根际区作物高氮需求，同时也可为土壤硝酸还原菌提供更多的硝态氮，进而提高了根际区硝酸酶活性。然而，非根际区土壤中硝酸还原酶活性显著降低很可能是由于氮肥施用并未影响非根际区脲酶活性，进而并不能增加其硝态氮含量，随着水稻根际区硝态氮的不断消耗，非根际区硝态氮含量也会有所降低，氮肥施用条件下非根际区土壤中硝酸还原酶活性因而也有所降低。

3.2 根际效应对稻田土壤酶活性的影响

土壤-微生物-作物根系互作系统组成的根际微环境，是土壤养分转化利用的热点区域，而土壤酶是其关键的中间介质[26-27]。本研究通过对比根际与非根际之间土壤酶活性的变化，发现根际效应对土壤酶活性变化的解释率最高，达到了32.8%（图5a），两种类型稻田根际区土壤脱氢酶活性、脲酶活性和羟胺还原酶活性都显著高于非根际区（图1、图2c和图2d、图3e 和图3f），且根际效应与土壤脱氢酶性、蛋白酶、脲酶和羟胺还原酶活性呈现显著的正相关性（图5b）。根际能产生这种效应可能主要有以下两方面原因：一方面，植物根系不断分泌各种代谢产物，包括有机酸、糖类、氨基酸、黄酮、生长素、核苷酸、酚酸类、脂肪酸和渊醇、酶类等，其可为微生物生长提供营养；另一方面，根表组织陆续死亡和脱落，改良了周围土壤的物理性质和化学性质，丰富了土壤有机质，从而为微生物的大量增殖创造了条件，使植物根际具有很高的酶活性[28]。

然而，根际区土壤酶活性并不都是显著高于非根际区。已有研究表明，水稻根际区是硝化-反硝化反应的重要热区。由于水稻根系分泌氧气有利于根际土壤硝化作用，从而产生更多硝酸根，为反硝化微生物提供更多的氮源，进而提高土壤反硝化酶的活性[29-30]。然而，水稻在生长过程中不断吸收同化和，与非根际土壤相比，根际区土壤硝态氮含量逐渐降低，可能会导致硝酸还原酶活性的降低。类似地，我们也发现，秸秆还田与不同量氮肥配施条件下，与非根际土壤相比，江苏泰州稻田根际区土壤硝酸还原酶活性较低（图3）。与江苏泰州土壤类似，秸秆直接还田条件下，江苏常州稻田根际区土壤硝酸还原酶活性也显著低于非根际区（图3）。

研究还发现，不同类型土壤中根际区酶活性对根际效应的响应存在显著性差异。与江苏泰州土壤相比，秸秆还田与氮肥配施下江苏常州稻田根际区土壤硝酸还原酶活性显著高于非根际区，这很可能是由于与江苏泰州土壤相比，江苏常州稻田具有较高的脲酶活性，而且根际区脲酶活性显著高于非根际区（S 处理除外），氮肥施用条件下，具有较高脲酶活性的根际土可产生较多的铵态氮，进而可为土壤硝酸还原酶提供更多的硝态氮。而秸秆与氮肥配施条件下，江苏泰州根际区土壤较高的亚硝酸还原酶活性很可能与根际区土壤密切相关[8]。此外已有研究发现，由于根际效应，与非根际土壤相比，根际区蛋白酶活性更高[31]。然而，本研究发现，秸秆还田且不施氮肥条件下水稻成熟期根际区与非根际区江苏泰州土壤蛋白酶活性并无显著性差异，这很可能与土壤氮含量相关。由于水稻生长后期需氮量并不高，且不施氮状况下土壤较低的氮含量进一步限制了蛋白酶活性。而秸秆还田配施氮肥增加了土壤氮含量，很可能刺激了土壤微生物生长，尤其是微生物活性较高的根际区，从而增加了土壤蛋白酶的来源，因此，江苏泰州根际土壤蛋白酶活性得到显著提高。而对于江苏常州稻田，土壤较高的含氮量很可能足够满足作物氮需求，无需根际土壤蛋白酶提供更多的氮源，因此，即使是在高量施用氮肥的条件下，根际与非根际两者之间土壤蛋白酶活性也并无显著差异。