层层自组装技术增强乳酸菌抗药性的综合实验教学设计

周文红， 汪双双，b， 阳 敏， 胡汉娇

（北部湾大学a.石油与化工学院；b.东密歇根联合工程学院，广西钦州 535011）

0 引 言

新时代高等教育发展背景下，在实验教学中开展综合创新性实验内容已成为目前实验课程改革的趋势之一［1-3］。细胞工程是生物化学、生物工程等专业的核心课程，是一门实践性很强的学科。细胞工程的基础实验对培养学生的实验操作技能及数据记录、处理等有显著效果，但“照方抓药式”的学习不利于培养学生主动学习、独立思考、解决实际问题的综合创新能力，无法适应认证教育体系的培养要求［4-5］。因此，本院积极推进实验教学改革，增设综合性实验［6-7］，将科研成果、企业应用、生活热点与实验教学相结合，在实验内容、教学方法、考核评价等方面做了诸多改革［6-10］。

笔者结合“益生菌”生活热点，设计了“LBL 技术增强乳酸菌抗药性”综合实验。乳酸菌是一种常见的益生菌，具有调节胃肠道、促进吸收的功能，在食品、饲料养殖等行业中广泛使用［11］。然而，乳酸菌容易被抗生素等药物灭活，使其活菌数量大大减少，难以达到应有的功效［12］。仿生细胞壁的研究与开发已成为目前研究热点之一，纳米涂层功能化的仿生细胞壁构筑，不仅可以起到保护细胞隔离有害物质、增强细胞间的通信等作用，而且具有细胞相容性，几乎不影响细胞的活性和生长［13-14］。本文通过乳酸菌培养、LBL 法包裹乳酸菌、乳酸菌抗药性来培养学生的自主学习能力、实验操作能力、问题解决能力和思维创新能力。

1 实验目的与原理

1.1 实验目的

通过文献调研，了解细胞培养技术，掌握乳酸菌的培养技术；了解人造细胞壁的结构特点及作用机制，掌握LBL技术及其表征方法；理解抗生素与细胞的作用原理；掌握可见分光光度计（UV-vis）、动态光散射仪（DLS）、倒置荧光显微镜（FIM）等仪器的工作原理及使用。整个实验的实践活动设计和能力目标培养如表1 所示。

表1 实践活动和能力目标关联

1.2 实验原理

LBL技术是一种表面修饰方法，基于带相反电荷的聚电解质在液/固界面通过静电作用交替沉积而形成多层膜。利用LBL 技术在益生菌表面覆盖仿生细胞壁，制备微囊化的乳酸菌来抵御环境中抗生素的危害，能大大提高益生菌的存活率。壳聚糖和葡聚糖是两种天然多糖，具有较好的生物相容性和可生物降解性。天然壳聚糖虽荷正电但水溶性差，而天然葡聚糖虽亲水性强但呈荷电中性，均不适合用于构筑仿生细胞壁。因此，选择两者的改性产物——羟丙基壳聚糖（HPCS）和羧基葡聚糖（DEX-COOH）为包封材料，用于构建双糖聚合膜来包封乳酸菌。乳酸菌表面荷负电，通过LBL方法先包覆上荷正电的HPCS，再包覆上荷负电的DEX-COOH，从而在乳酸菌的表面形成仿生细胞壁，降低乳酸菌在抗生素环境中的死亡率。通过FIM等对仿生细胞壁进行定性定量的表征，最后采用FIM观察包覆前后乳酸菌在抗生素环境中的存活率。

1.3 实验材料

实验试剂：乳酸菌，酵母膏，蛋白胨，葡萄糖，单宁酸，HPCS，DEX-COOH。

实验仪器：FIM，UV-vis，DLS，立式振荡培养箱，离心机，移液枪，高压灭菌锅等。

2 实验教学过程设计

本实验通过从实验设计、实验操作、汇报交流、实验报告4 个环节来达成教学目标，为进一步发挥综合实验的趣味性、自主性和探究性功能，开展“教师引导、学生探究”的教学模式［15］，实验采用“小组合作学习”的综合实验教学流程，具体实施方案如图1 所示。实验教学过程主要包括：①实验准备；②实验部分，包括乳酸菌培养、双糖聚合膜包覆乳酸菌的制备、乳酸菌抗药性研究；③拓展实验。实验准备是让学生了解本试验的目的、内容及相关研究的进展，要求学生进行文献综述和设计实验方案并完成预习报告。开放性拓展实验是学生在规定的课时内完成实验后，再继续考察不同种类的抗生素药物对包覆前后的乳酸菌存活率的影响等实验，以开拓学生视野。整个实验过程需在规定的教学时间（20 课时）内完成，实验准备工作和拓展实验在课外时间完成。由于实验流程长、工作量大，以3 或4 名学生为小组完成实验，实验前由组长和组员协商分工，有助于培养学生的沟通交流、团队协作能力。

2.1 实验准备

在实验讲座中介绍益生菌的功效和应用，并提出乳酸菌耐药性的研究热点，设定“LBL 增强乳酸菌抗药性”实验题目，将实验内容、目的、主要仪器设备的说明等材料发给学生，学生用2 周时间完成实验预习报告。实验预习报告包括文献综述和实验设计两部分，文献综述应包括乳酸菌的益生特性及应用领域；壳聚糖和葡聚糖的特性及改性产品种类及其性质；LBL技术的原理等内容。实验设计要求学生分析LBL 技术制备微囊化乳酸菌的过程、结果的表征手段，提出合理的实验方案。每组学生通过小组内查阅文献、讨论并拟定实验方案，制订实验步骤，教师在实验前1 周收集预习报告，对学生实验方案的可行性和安全性进行评估。在实验前开设1 次实验讨论课，教师针对学生的实验方案提出修改建议，并指导学生进行修改。该环节培养学生搜索及阅读文献的能力，最大限度地给予学生独立思考的空间，感受探究乐趣。

2.2 实验内容

（1）乳酸菌培养。乳酸菌培养流程如图2 所示。实验过程全程需在无菌室内进行，因此在进入无菌室时要提醒学生做好个人灭菌处理，教师提前准备好灭菌所需材料和工具。酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖的配比由学生自行决定，鼓励学生发挥实验自主性。溶液的灭菌需在高压灭菌锅中120 ℃灭菌20 min。灭菌结束后将两份灭菌后的溶液趁热混合均匀，获得培养基溶液。从固体培养基中取一小撮乳酸菌放入培养基溶液中，在37 ℃的摇床中培养15.0 h（或放置过夜），培养后的乳酸菌用灭菌去离子水清洗、收集备用。乳酸菌培养的前期操作约需要3 课时，但由于采用培养液培养的乳酸菌不能长时间放置，因此本实验建议安排连续两天的课程，一次性完成。

图2 乳酸菌培养流程图

乳酸菌有杆菌和球菌之分，笔者实验用乳酸菌为球菌。由于实验条件有限，学校未配备有扫描电子显微镜等高精密电镜，笔者利用FIM（25 μm）在明场下观察乳酸菌培养的纯度和菌落数，如图3 所示，菌体为典型的球状形态，随机分散于溶液中。如果显微镜下菌粒外观不一，则可能混入了杂菌。让学生分析操作不当之处，再重新培养。

图3 FIM观察乳酸菌的菌落数及菌体形态

（2）LBL法包覆乳酸菌的制备。该部分内容主要分4 步进行：确定形成聚合膜的双糖浓度比；配制合适浓度的乳酸菌溶液；HPCS 的包覆；DEX-COOH 的包覆。

①形成聚合膜双糖浓度比的确定。包覆前，需先考察HPCS 与DEX-COOH 的最佳浓度比以获得最稳定的聚合膜［12］。将两者按不同浓度比例充分混合后，自组装形成类似于囊泡状的凝聚微滴，采用显微镜观察一段时间前后凝聚微滴的变化，取凝聚微滴外膜表面最光滑、尺寸均一、结构最稳定的那一组，此时团聚体的形成效率高，可确定为两者的最佳浓度比。

指导教师前期的预实验结果表明（见图4），当HPCS浓度为2.50 mg/mL 时，与5.00 mg/mL DEXCOOH形成的聚合膜表面光滑、尺寸均匀［图4（c）］，且一段时间后没有爆裂［图4（d）］，说明结构稳定；而当HPCS浓度为5.00 mg/mL 时，与DEX-COOH 形成的聚合膜尺寸不均一［图4（a）］，一段时间后聚合膜完全破裂、变形［图4（b）］，说明结构不稳定。因此可初步判断HPCS 和DEX-COOH 形成聚合膜较佳质量浓度比为1∶2。对于此实验内容，要求学生独立操作仪器进行显微镜成像拍片，并对实验现象进行解释说明。同时，根据实验现象设定问题，比如：①凝聚微滴的稳定性为何不好？②形成凝聚微滴的作用机理是什么？要求学生查阅相关文献，在实验报告中回答相关实验问题，进而培养他们实际操作能力及分析问题能力。

图4 DEX-COOH（5.00 mg/mL）分别与（a）5.00 mg/mL、（c）2.50 mg/mL HPCS水溶液形成聚合膜的显微镜图像及60 min后（b、d）的显微镜图像

②双糖聚合膜包覆乳酸菌的制备。确定好聚合膜浓度比之后，还需进一步调节乳酸菌与水的比例获得合适的乳酸菌溶液，采用UV-vis在λ =600 nm处测量溶液的光密度（OD600）［16］，将OD600值调整为1（乳酸菌的浓度约为2 ×109cfu/mL）。在调好浓度的乳酸菌溶液中，依次加入一定浓度的单宁酸（TA）、HPCS以及DEX-COOH（见图5），每加一种溶液均需充分混匀并离心洗涤，去掉多余的物质。

图5 微囊化乳酸菌制备的流程图

利用静电作用使乳酸菌能均匀包覆上HPCS 和DEX-COOH形成双糖聚合膜构成的人工细胞壁。加入TA的目的是增强乳酸菌表面的荷负电程度，从而能更均匀的包覆上HPCS。整个过程的溶液均是乳白色的悬浮液，包覆前后的细胞液无明显变化，如加入HPCS或DEX-COOH时溶液出现团聚现象，则是由于分散不均匀导致包覆失败，此时需重新配制乳酸菌溶液。

采用DLS记录微囊化乳酸菌制备过程中各个阶段的Zeta电位的变化情况，预期的结果如图6 所示。纯乳酸菌溶液的荷负电的，当加入TA 以后负离子化程度增加，在HPCS 溶液对乳酸菌充分涂层后的电势为正值，最后经DEX-COOH溶液涂层的乳酸菌溶液电势为负值，包覆后的细胞与天然细胞的电势相近，证明该人造细胞壁的构筑对乳酸菌细胞的表面电位没有产生较大影响。对于双糖聚合膜包覆乳酸菌后的产物表征，要求学生独立操作倒置显微镜和动态衍射仪进行最佳微滴构筑及Zeta 电位的测试，对HPCS 与DEXCOOH形成的最佳凝聚微滴所需的浓度进行阐述说明，并对双糖聚合膜包覆乳酸菌过程中各阶段的Zeta电位变化进行分析，充分起到培养学生独立自主操作精密仪器的能力及分析实验现象的能力。根据实验现象设置如下讨论问题：①乳酸菌细胞液为何要调试OD600为1？②反应过程中为何要加入单宁酸水溶液？不加会导致什么实验现象？③包覆实验过程中为何先包HPCS再到DEX-COOH？要求学生通过查阅相关文献，结合实验现象进行问题讨论，得出实验结论，进而培养学生独立操作实验的技能及提出问题、分析问题、解决问题的系列能力。

图6 HPCS/DEX-COOH聚合膜包覆乳酸菌过程的Zeta电位变化

（3）乳酸菌抗药性分析。取一定量包覆前、后的乳酸菌放入到具有一定浓度的诺氟沙星溶液中，同时在溶液中加入荧光素双醋酸酯（FDA）和碘化丙啶（PI）进行双荧光染色，采用荧光显微镜进行测试样品在明场光学显微镜下与暗场荧光显微镜下的性质变化观察，通过显微镜观察细胞的死活情况。预期的结果如图7 所示，包覆前后的乳酸菌在0.4 mg/mL诺氟沙星相互作用之后，包覆后的乳酸菌中活菌数量较比天然乳酸菌细胞中的活菌数量明显增多，细胞存活率升高。由此表明仿生细胞壁对乳酸菌在诺氟沙星环境中具有较好的保护作用。通过双糖聚合膜包覆乳酸菌的抗药性研究实验，使学生掌握荧光显微镜的操作技能，观察乳酸菌细胞的死活情况，解释双糖聚合膜包覆乳酸菌的抗药性能，能够培养学生独立自主操作精密仪器的技能及分析实验结果的能力。

2.3 开放性拓展试验

乳酸菌表面荷负电，易受到荷正电的诺氟沙星等抗生素的胁迫而降低细胞存活率。本实验所制备的微囊化乳酸菌表面包覆上两层荷电相反的物质，能将荷电的小分子吸附在包覆层而阻止其到达细胞表面，因此具有一定的抵御外界环境胁迫的能力。基于此，鼓励学生将包覆前、后的乳酸菌分别暴露于不同种类的抗生素溶液中，在显微镜下观察对比细胞的存活率，验证仿生细胞壁对乳酸菌在不同抗生素环境中是否均具有保护作用，作为开放性拓展实验。在拓展实验过程中，教师负责指导FIM 仪器的使用，学生负责设计实验方案，考察多种抗生素及其浓度与细胞存活率的关系。拓展试验为学生提供更多创新训练的机会，由学生利用课外时间完成，旨在使学生在解决问题的过程中感受到自己智慧的力量，体验到创新成功的快乐，从而激发学生的问题意识，培养创新能力。此部分的实验属于非强制性内容，学生根据自己的需求进行，最后可酌情对总成绩予以加分（20 分以内）。

3 实验评价体系

本实验考核方式采用理论知识和能力要素相结合，过程考核和结果考核相结合、实验操作与实验报告相结合的方式，旨在全面考核学生的综合实践能力。实验考核由教师、学生（自评）和小组成员（互评）3 个主体从实验准备、实验过程、汇报交流、实验报告等4个环节，分别对实验反思、课堂参与、实验操作、实验报告及实验素养等方面进行评价。实验评价体系如表2所示，首次将反省认知、自主学习列为评价的重要内容，并且评价内容与能力要素相对应，旨在对学生实验的全过程多维度进行考核。为了培养学生的科技论文写作能力，要求学生以科技论文的格式书写，并以此作为实验报告提交。

表2 能力导向的综合实验评价体系

4 结 语

此实验在本校2018 级化学专业本科生（5 人）和2019 级研究生（2 人）的课外开放实验中得到完善和检验，能够有效衔接生物、化学、仪器分析的课程实验内容，使学生的实验操作和仪器使用能力得到锻炼和提升，有效提高理论知识和实际应用的综合实践能力，并对学生完成大学生创新创业项目和毕业论文打下良好的基础。本实验首次开设，本科学生能够较容易掌握制备方法和实验操作，但是在数据处理和用Origin、Photoshop等软件作图耗时较长，日后应该加强这方面的培训工作。实践活动与能力目标密切关联、评价内容与能力要素一致的设计理念值得推广，对于内容为实验的实践类课程提供了很好的借鉴。