多算法荧光涨落超分辨显微集成平台

李文波， 邱 锦， 许必晴， 许灿华， 黄衍堂， 曾志平

（福州大学物理与信息工程学院，福州 350108）

0 引 言

荧光显微成像技术广泛应用于细胞微结构及其功能的研究，然而细胞内部的大多数细胞器尺寸远小于光学衍射极限，传统的光学显微成像系统无法对细胞内部的精细结构和细胞器相互作用进行清晰成像和监测。

为了观察到亚细胞结构和细胞内部的运作机理，研究人员发明出了多种超分辨光学显微系统，如受激发射损耗超分辨显微成像［1-2］、结构光照明显微成像［3］、单分子定位显微成像［4］、基于荧光涨落的超分辨显微成像等方法［5-7］。目前已有多种荧光涨落超分辨成像算法，如超分辨光学涨落成像算法［8-10］（Superresolution Optical Fluctuation Imaging，SOFI）、超分辨径向涨落成像算法［11-12］（Super-Resolution Radial Fluctuations，SRRF）、多信号分类成像算法［13］（Multiple Signal Classification Algorithm，MUSICAL）、基于熵值分析的超分辨成像算法［14］（Entropy-based Super-resolution Imaging，ESI）等，这些算法在不同成像帧数、荧光涨落频率等条件下能够各自取得分辨率的显著提升。

在荧光涨落超分辨成像的应用中，目前缺乏一个能够同时对荧光涨落图像序列进行多算法处理的集成系统平台。对此，本文开发了多算法荧光涨落集成超分辨显微成像软件平台，能够对荧光涨落超分辨成像进行多算法对比和超分辨图像质量评价及优化。

1 基于荧光涨落的光学超分辨成像原理

（1）荧光涨落。在传统的光学显微成像中，样本中每个发光点源在经过成像系统被采集到时均扩散成了一个艾里斑。随着两个点源距离的减小，艾里斑的叠加无法被有效分辨出来，如图1 所示。这一现象限制了光学显微成像系统分辨率的进一步提高，对于可见光成像，该分辨率极限大概约在200 nm。通过荧光标记技术与荧光涨落特性能够突破光学衍射分辨率极限，免疫荧光标记技术的原理是将荧光分子固定在抗体上再与细胞中相应的抗原进行结合，从而可以清楚观察到对应的蛋白分子，这是常用的观察细胞内部结构的方法之一。用于细胞标记的荧光分子在激发光的照射下，电子吸收能量从基态（S0）跃迁到激发态（S1），当电子从激发态回落到基态时发出荧光，如图2所示。对于量子点、有机荧光分子和部分荧光蛋白，激发的过程中，荧光信号发光强度并不是恒定不变的，会随着时间产生随机波动，这一现象就是荧光随机涨落现象，称为荧光间歇性，如图3 所示。量子点的荧光时间闪烁特性呈现出幂次定律的概率分布，这与系统噪声的分布特征有着明显的区别，且各个量子点之间的荧光涨落具有相互独立性，为基于荧光涨落特性实现图像空间分辨率和信噪比的提升提供理论上的可行性。

图1 2个荧光光源下不同距离的荧光分布

图2 Jablonski荧光发光原理

图3 荧光涨落强度和背景噪声强度随时间变化示意

（2）SOFI 算法原理。基于荧光涨落的超分辨显微技术能够通过荧光分子的随机涨落特性提升成像空间分辨率。SOFI算法［8］通过计算图像序列的n 阶累积量函数，将图像序列的点扩散函数减小n 倍。宽场荧光显微成像的点扩散函数近似于二维高斯分布，通过SOFI 分析能够将其半峰全宽减小倍，从而实现倍的空间分辨率提升。

（3）SRRF算法原理。SRRF［11］根据图像序列中点扩散函数的径向对称性，通过计算图像梯度场分布的径向度，以较高的精度确定荧光分子中心区域的位置。然后通过荧光显微镜采集多帧荧光涨落图像序列，结合荧光分子的时间涨落特性提高成像的空间分辨率。

其他基于荧光涨落的超分辨显微技术通过采用不同的数学函数进行分析，比如MUSICAL［13］依赖于奇异值分解求解本征图像，ESI［14］通过计算图像序列的信息熵等函数分析，显著提升荧光显微成像的空间分辨率。

2 多算法重建图像对比

2.1 多算法仿真与分析

2.1.1 荧光信号仿真

（1）仿真过程。荧光涨落信号的仿真过程如图4所示，使用仿真亚细胞精细结构来模拟细胞中被标记的蛋白，再将其与二维高斯函数卷积模拟点光源经过光学显微镜系统衍射后捕获的图像。

图4 多算法荧光涨落超分辨显微成像仿真过程

（2）超分辨算法重建参数。通过仿真获得100 帧图像序列，对其进行SOFI、SRRF、ESI 和MUSICAL 处理，其结果如图5 所示。SRRF 参数为插件默认值。ESI则进行2 次迭代：第1 次参数：output=10，Order=1。然后将生成的10 帧序列进行第2 次迭代，第2 次参数：output=1，Order =1。MUSICAL 程序设置参数：Value=0，Alpha=10，frames=100。

图5 荧光涨落仿真图像及其超分辨算法处理结果 （a）图像序列的宽场图像，（b）宽场图像局部放大图，（c）二阶SOFI重建图像，（d）MUSICAL重建图像，（e）SRRF重建图像，（f）ESI重建图像

2.1.2 仿真结果分析

使用分辨率缩放皮尔逊系数（Resolution-Scaled Pearson coefficient，RSP）［15］、分辨率缩放误差（Resolution-Scaled Error，RSE）［15］、强度相对误差K、信噪比SNR表征每种算法重建图像的质量，表达式分别为：

表1 不同超分辨算法下仿真图像重建质量对比

图5 所示为荧光涨落仿真图像及超分辨算法处理结果。图6 所示为图5 黄线x1处的归一化强度曲线。由图6 可知，4 种算法均在一定程度上提升了图像的分辨率。从图中曲线可看出宽场图像无法显示微管交叉处的结构；二阶SOFI与ESI仅能勉强显示出2 个峰值；SRRF能够有效分辨距离130 nm 的交叉结构，但是其峰值处强度波动明显，说明重建图像的均匀性较差，这与强度的K 表征结果一致；MUSICAL 重建图像在微管结构交叉处的分辨率得到明显提升，能够将交叉结构处信号分离。但是交叉处的微管结构出现了明显的形变，峰值坐标产生了位移，这与RSE 所反应结果相同，重建误差最大。MUSICAL算法是采用小窗口逐个移动实现超分辨算法，需要对每个小窗口进行处理，其计算时长远大于另外3 种算法。

图6 宽场图像以及4种超分辨算法重建图像在仿真微管交叉点处的强度分布曲线

在仿真图像中加入高斯噪声模拟更加真实的信号采集条件，并通过均值偏移算法（Mean-Shift Super Resolution，MSSR）［16］对图像序列进行降噪预处理。MSSR算法通过计算平均偏移矢量的局部幅度峰值识别荧光和噪声信号，并降低噪声信号强度和优化图像分辨率，再使用SOFI、SRRF、ESI 超分辨算法重建，如图7 所示。图8 所示为图7 中黄线x2处归一化强度曲线。对比图8 可见，经过MSSR 算法预处理的3 种算法的重建图像的背景噪声强度比直接使用超分辨算法处理的强度低，与图9 红圈内的结果相一致。与此同时，MSSR-SOFI 还进一步提升了重建分辨率。

图8 宽场图像、MSSR-宽场、SOFI、MSSR-SOFI亚细胞微管交叉点处的强度分布曲线

图9 荧光涨落实验图像及4 种超分辨算法重建图像结果（a）亚细胞微管蛋白宽场平均图像，（b）为宽场图像局部放大图，（c）四阶SOFI 及MSSR-SOFI 重建图像，（d）MUSICAL 及MSSR-MUSICAL 重建图像，（e）SRRF 及MSSR-SRRF重建图像，（f）ESI及MSSR-ESI重建图像

2.2 多算法实验与分析

2.2.1 实验过程

（1）实验步骤。①对细胞使用40 mL/L甲醛固定15 min，然后使用1 ×PBS（Phosphate Buffered Saline）磷酸盐缓冲液进行3 次清洗；②使用3 mL/L Triton X-100 溶液对细胞进行渗透方便染色，渗透后进行3 次清洗；③使用50 mL/L羊血清蛋白的PBT溶液对细胞进行封闭处理，消除抗体的非特异性结合；④使用一抗孵育细胞过夜，孵育结束使用1 ×PBS 清洗3 次；⑤使用对应的二抗孵育细胞；⑥细胞封片，并使用荧光相机捕获微管蛋白图像序列。

（2）超分辨算法运行参数。对图像序列使用4 种超分辨算法处理，并对超分辨图像进行重建质量评价，结果见表2 所示。ESI算法为2 次迭代，①output=5，Order=1；②output =1，Order =1。MUSICAL 程序参数Value= -0.3，Alpha=5，frames=100。SRRF程序参数：Ring Radius=0.7，其余为默认值。

表2 不同超分辨算法下实验图像重建质量对比

2.2.2 实验结果分析

图9 所示为荧光涨落实验图像及4 种超分辨算法重建结果。图10 所示为图9 中黄线x3处的归一化强度分布。其中，图9（a）为微管蛋白图像序列求平均强度分布图，截取宽场部分区域［见图9（b）］，对图像序列使用MSSR算法预处理提高信噪比再进行超分辨算法处理，结果如图9（c）～（f）白线上半部分所示，直接使用超分辨算法处理图像序列，结果如图10（f）白线下半部分所示。宽场图像信号的分辨率较低，微管交叉位置无法有效分辨微管结构。

图10 宽场图像及4种超分辨算法重建图像在亚细胞微管交叉点处的强度分布曲线

（1）MUSICAL 重建结果分析。MUSICAL 获得了比较好的重建效果，成功分离2 个微管在交叉处的信号。但是重建图像K 值最高，微管结构的均匀性较差，RSE误差也最大。

（2）SRRF 重建结果分析。SRRF 重建结果能够将微管交叉区域很好地分离开，有效地提高了图像分辨率。但是SRRF出现了使整个图像结构变窄和微管结构不连续的情况。

（3）SOFI重建结果分析。SOFI 算法的重建图像强度曲线结果仅能够分离开2 个峰值分布，无法有效区分细胞微管的交叉结构精细分布。因为处理的图像只有100 帧，无法满足4 阶SOFI 所要求的帧数，使得部分荧光信号消失。

（4）ESI重建结果分析。经过2 次迭代的ESI 算法能够有效分开微管交叉区域，RSE误差最低，同时2次迭代的过程中也消除背景噪声，获得了比较高的信噪比。ESI算法通过计算图像序列的信息熵实现超分辨成像，像素接收到的信号越多，荧光波动越大，熵值越高。因此，在图9（f）右下角区域的高荧光信号密度区域出现了高亮现象，无法有效区分其中的信号。

对比图9（c）～（f）白线上下两部分可以明显看出，使用MSSR算法预处理的重建图像信噪比更高，不过图像均匀性都出现了一定程度的下降，需根据实际的应用需求进行选择。

3 结 语

本文开发了多算法荧光涨落超分辨显微集成平台，能够用于模拟生成随机涨落的荧光信号，以及执行4 种基于荧光随机涨落的超分辨算法图像重建。通过仿真生成一组荧光涨落信号序列以及实验制备一组微管蛋白荧光序列得到2 组图像序列，并使用4 种基于荧光涨落的超分辨算法以及均值偏移算法对2 组数据进行处理得到超分辨算法重建图像，结果表明：①4种超分辨算法均能提高荧光图像的分辨率，实现倍左右空间分辨率提升；②使用MSSR进行降噪预处理能够有效提高重建图像的信噪比。本文开发的超分辨显微成像集成平台能够用于多算法亚细胞荧光超分辨成像研究、光学显微成像教学演示以及物理光学科普展示等多方面应用，为生命科学与医学研究提供高效的超分辨成像技术平台。