晚期NSCLC放疗前后血清circPVT1和miR-486-5p水平变化及临床意义

张天伟　张金标　张燕　明汇　张鹏　聂东

摘要：目的 探討晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者放疗前后血清环状RNA浆细胞瘤转化迁移基因1（circPVT1）、微小RNA-486-5p（miR-486-5p）水平变化及对放疗疗效的评估价值。方法 研究纳入137例晚期NSCLC患者作为NSCLC组，另选取健康体检者140例作为对照组。采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测血清circPVT1、miR-486-5p表达水平，比较放疗前后及不同放疗疗效患者血清circPVT1和miR-486-5p水平；受试者工作特征（ROC）曲线分析血清circPVT1、miR-486-5p水平对放疗疗效的诊断价值。结果 与对照组相比，NSCLC组放疗前血清circPVT1表达水平升高，miR-486-5p表达水平降低（P＜0.05）；经Targetscan在线分析显示，circPVT1与miR-486-5p有靶向关系；鳞癌与腺癌NSCLC患者放疗前血清circPVT1、miR-486-5p表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与TNM分期Ⅲ期患者相比，Ⅳ期患者血清circPVT1表达水平升高，miR-486-5p表达水平降低（P＜0.05）；与放疗前相比，放疗后患者血清circPVT1表达水平降低，miR-486-5p表达水平升高（P＜0.05）。与放疗有效组相比，无效组放疗前和放疗后血清circPVT1表达水平升高，miR-486-5p表达水平降低（P＜0.05）；与放疗前相比，放疗有效组和无效组在放疗后均显示血清circPVT1水平降低，而miR-486-5p水平升高（P＜0.01）。血清circPVT1、miR-486-5p联合诊断放疗无效的AUC为0.918（95%CI：0.859～0.958），敏感度为80.65%，特异度为88.00%，联合诊断效能优于单独诊断。结论 血清circPVT1、miR-486-5p水平对晚期NSCLC放疗疗效有一定评估价值。

关键词：癌，非小细胞肺；RNA，环状；化放疗；环状RNA浆细胞瘤转化迁移基因1；微小RNA-486-5p

中图分类号：R734.2文献标志码：ADOI：10.11958/20230346

Changes and clinical significance of serum circPVT1 and miR-486-5p levels before and after radiotherapy for advanced NSCLC

ZHANG Tianwei， ZHANG Jinbiao ZHANG Yan， MING Hui， ZHANG Peng， NIE Dong

Department of Tumor Blood Radiotherapy， Zibo 148th Hospital， Zibo 255300， China

Corresponding Author E-mail： zjb20220620@126.com

Abstract： Objective To investigate changes of serum levels of circulating RNA plasmacytoma variant translocation 1 （circPVT1） and microRNA-486-5p （miR-486-5p） before and after radiotherapy in patients with advanced non-small cell lung cancer （NSCLC） and their evaluation value for radiotherapy efficacy. Methods A total of 137 patients with advanced NSCLC were selected as the NSCLC group， and 140 health examination personnel in our hospital were selected as the control group. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） was applied to detect serum expression levels of circPVT1 and miR-486-5p. Serum levels of circPVT1 and miR-486-5p before and after radiotherapy were compared. Receiver operating characteristic （ROC） curve was applied to analyze the diagnostic value of serum circPVT1 and miR-486-5p levels for radiotherapy efficacy. Results Compared with the control group， the serum expression level of circPVT1 was obviously higher before radiotherapy in the NSCLC group， and the expression level of miR-486-5p was obviously lower （P＜0.05）. According to Targetscan online analysis， circPVT1 had a targeted relationship with miR-486-5p. There were no significant differences in serum expression levels of circPVT1 and miR-486-5p before radiotherapy between patients with squamous cell carcinoma and adenocarcinoma NSCLC （P＞0.05）. Compared with TNM stage Ⅲ group， the serum expression level of circPVT1 was obviously higher in patients with stage IV NSCLC， and serum expression level of miR-486-5p was obviously lower （P＜0.05）. The serum expression level of circPVT1 was obviously lower in patients after radiotherapy than that before radiotherapy， and the expression level of miR-486-5p was obviously higher （P＜0.05）. Compared with the effective radiotherapy group， the serum expression level of circPVT1 was increased and the expression level of miR-486-5p was decreased before and after radiotherapy in the ineffective group （P＜0.05）. Compared with before radiotherapy， both the effective and ineffective radiotherapy groups showed a decreased serum circPVT1 level and an increased miR-486-5p level after radiotherapy （P＜0.05）. The AUC （95%CI： 0.859-0.958） of combined diagnosis of serum circPVT1 and miR-486-5p was 0.918， the sensitivity was 80.65% and the specificity was 88.00%. The combined diagnosis was better than single diagnosis （Z=2.06， 2.024， P＜0.05）. Conclusion Serum levels of circPVT1 and miR-486-5p have certain value in evaluating the efficacy of radiotherapy for advanced NSCLC.

Key words： carcinoma， non-small-cell lung; RNA， circular; chemoradiotherapy; cyclic RNA plasmacytoma variant translocation 1; micro RNA-486-5p

非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌的主要病理类型，除少数早期患者可通过手术治疗外，多数患者采用放疗、化疗或两者相结合的治疗方式。虽然NSCLC的治疗取得一定进步，但患者预后存在较大差异，因此寻找与预后相关的分子标志物对临床指导治疗具有重要意义。环状RNA浆细胞瘤转化迁移基因1（circPVT1）是一种环状RNA，在肺癌、鼻咽癌等多种肿瘤中呈高表达，其通过调控靶基因表达，促进肿瘤生长与转移［1-2］。研究显示，在NSCLC细胞中，沉默circPVT1表达可通过上调miR-1208表达增强NSCLC细胞的放射敏感性［3］，提示circPVT1与NSCLC的放疗有关。经Targetscan在线分析显示，circPVT1与miR-486-5p有靶向结合位点，miR-486-5p在NSCLC中呈低表达，发挥抑癌基因的作用［4］。研究显示，大蒜素通过上调miR-486-5p表达，抑制肺癌细胞增殖、侵袭，增强细胞对X线的敏感性［5］。本研究探讨circPVT1、miR-486-5p与NSCLC放疗疗效的相关性，为NSCLC的治疗提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2020年9月—2022年6月在淄博一四八医院进行治疗的137例晚期NSCLC患者作为NSCLC组，其中男83例，女54例，年龄42～75岁，平均（57.56±8.05）岁，病理类型腺癌75例，鳞癌62例，根据国际抗癌联盟（UICC）第8版肺癌TNM分期，Ⅲ期81例，Ⅳ期56例。纳入标准：（1）患者均经病理诊断为原发性NSCLC，TNM分期Ⅲ—Ⅳ期。（2）不符合手术治疗指征，无放疗禁忌证。（3）入组前1个月内未接受放化疗及免疫治疗。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤患者。（2）严重器质性疾病患者。（3）重度贫血、自身免疫性疾病患者。（4）精神疾病或认知障碍者。选择同期在本院健康体检者140例作为对照组，其中男77例，女63例，年龄45～78岁，平均（58.34±10.05）岁。2组性别（c2=0.885）、年龄（t=0.715）比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究通过医院伦理委员会批准（伦理号：ysbyy202316）。

1.2 方法

1.2.1 治疗 采用新华医疗器械有限公司的医用电子直线加速器（型号：600E）进行放疗，定位CT为国产64排螺旋CT，采用常规放疗方案，按照肿瘤靶区（GTV）、临床靶区（CTV）及计划靶区（PTV）设置3～5个照射区，放射源为6 MV X线，每次2～3 Gy，每周5次，放疗周期4～6周，总剂量60～70 Gy，放疗结束后观察4周评价治疗效果。

1.2.2 疗效评估 参照实体瘤疗效评价标准RECIST指南，分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、疾病稳定（SD）与疾病进展（PD）；有效=CR+PR。

1.2.3 实时荧光定量PCR（qPCR）检测血清circPVT1、miR-486-5p表达 采集患者放疗前及放疗后4周空腹静脉血5 mL，对照组采集体检当天空腹静脉血5 mL，3 000×g离心20 min，分离血清，-70 ℃冰箱保存。使用Trizol试剂（北京百奥莱博科技有限公司）提取血清总RNA，并用PrimeScript RT-PCR试剂盒（日本TaKaRa公司公司）反转录。使用分光光度计分析RNA浓度与纯度后，取1 μg RNA使用qPCR检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）进行PCR扩增，反應体系50 μL，其中Taq/RTase Mix Ⅱ 2 μL，2×One Step RT-PCR Buffer 25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，加双蒸水至50 μL。反应条件：45 ℃反转录30 min，94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃终延伸5 min。circPVT1、miR-486-5p及内参引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司。circPVT1引物：上游5′-GGTTCCACCAGCGTTATTC-3′，下游5′-CAACTTCCTTTGGGTCTCC-3′；miR-486-5p引物：上游5′-ACACTCCAGCTGGGTCCTGTACTGAGCTGCCCCGAG-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；GAPDH引物：上游5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGTT-3′，下游5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′；U6引物：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下游5′-TTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′。PCR反应结束后，分别以GAPDH、U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算circPVT1、miR-486-5p相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行数据分析，实验数据符合正态分布的用x±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，配对样本采用配对t检验；计数资料使用例（%）表示，组间比较采用χ²检验；受试者工作特征（ROC）曲线分析血清circPVT1、miR-486-5p水平对放疗疗效的诊断价值。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 对照组与NSCLC患者血清circPVT1、miR-486-5p表达水平比较 与对照组比较，NSCLC组放疗前血清circPVT1表达水平显著升高，miR-486-5p表达水平显著降低（P＜0.01）。与放疗前比较，放疗后患者血清circPVT1表达水平降低（P＜0.01），miR-486-5p表达水平升高（P＜0.01）。见表1。

2.2 circPVT1与miR-486-5p靶向关系 经Targetscan在线分析显示，circPVT1与miR-486-5p具有靶向关系，见图1。

2.3 NSCLC患者放疗前不同病理类型与分期血清circPVT1、miR-486-5p表达水平比较 鳞癌与腺癌NSCLC患者放疗前血清circPVT1和miR-486-5p表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与TNM Ⅲ期患者比较，Ⅳ期患者血清circPVT1表达水平升高，miR-486-5p表达水平降低（P＜0.01），见表2。

2.4 NSCLC放疗不同疗效血清circPVT1、miR-486-5p表达水平比较 137例患者中，CR患者3例（2.2%），PR患者72例（52.6%），SD患者18例（13.1%），PD患者44例（32.1%），放疗近期总有效患者75例（54.7%），无效患者62例（45.3%）。与放疗有效组相比，无效组放疗前和放疗后血清circPVT1表达水平升高，miR-486-5p表达水平降低（P＜0.05）；与放疗前相比，放疗后的有效组和无效组中血清circPVT1表达水平降低，miR-486-5p表达水平升高（P＜0.05），见表3。

2.5 放疗前血清circPVT1、miR-486-5p水平对放疗疗效的诊断价值 放疗前血清circPVT1、miR-486-5p及两者联合诊断放疗无效的ROC曲线见图1；曲线下面积（AUC）、截断值、敏感度、特异度及约登指数见表4；联合诊断效能优于单独诊断（Z分别为2.006和2.024，P＜0.05）。

3 讨论

NSCLC为常见的惡性肿瘤，晚期NSCLC患者的5年生存率不到20%［6］，放疗作为不能手术NSCLC患者的一种治疗手段，可延长患者生存期，改善预后。由于受多种因素影响，患者放疗后疗效差异较大，因此有效评估放疗疗效有利于制定个体化治疗方案，改善患者预后［7-8］。

circRNA通过吸收miRNA靶向调节基因表达，参与调节细胞增殖、血管生成、能量代谢等多种过程，参与肿瘤的发生发展及耐药性。研究显示，circRNA可在外周血和组织液中稳定表达，可能是肿瘤鉴别诊断、判断疗效与评估预后的标志物［9］。circPVT1在NSCLC［3］、胃癌［10］、乳腺癌［11］、甲状腺癌［12］等多种肿瘤中表达水平升高，发挥促癌基因的作用，抑制其表达可抑制肿瘤细胞增殖与侵袭，从而抑制肿瘤生长。研究显示，circPVT1在肺鳞状细胞癌患者组织、细胞及血清中表达上调，circPVT1作为miR-30d和miR-30e的竞争性内源性RNA调节细胞周期蛋白F表达，促进肺鳞状细胞癌的进展［13］。本研究经Targetscan在线分析显示，circPVT1与miR-486-5p存在靶向结合位点。miR-486-5p在肺癌［14］、乳腺癌［15］、结直肠癌［16］等肿瘤中表达下调，过表达miR-486-5p可抑制肿瘤细胞增殖与迁移。本研究结果显示，NSCLC患者血清circPVT1表达水平高于对照组，miR-486-5p表达水平低于对照组，且与Ⅲ期患者比较，Ⅳ期患者血清circPVT1表达水平升高，miR-486-5p表达水平降低，与前文报道结果类似［3，14］，提示circPVT1、miR-486-5p与NSCLC的发生发展密切相关。

有研究显示，circPVT1、miR-486-5p在肿瘤细胞放疗、化疗耐药中起着重要作用［17］。circPVT1与NSCLC患者肿瘤分化程度或TNM分期及不良预后相关，经顺铂联合吉西他滨化疗后，circPVT1表达降低，且化疗耐药患者的circPVT1表达高于化疗敏感患者［18］。在结肠癌中，lncRNA PVT1通过调控miR-486-5p/CDK4轴促进结肠癌细胞对5-FU的耐药性［19］。本研究结果显示，放疗后患者血清circPVT1表达水平低于放疗前，miR-486-5p水平高于放疗前，且与放疗有效组相比，放疗无效组血清circPVT1表达水平升高，miR-486-5p表达水平降低，提示检测血清circPVT1、miR-486-5p水平可反映化疗效果，对NSCLC的治疗有一定指导意义。分析其可能的原因是，高水平circPVT1和低水平miR-486-5p促进NSCLC的进展，影响化疗效果。本研究通过ROC曲线分析发现，血清circPVT1、miR-486-5p联合诊断放疗无效的AUC为0.918，敏感度为80.65%，特异度为88.00%，联合诊断效能优于单独诊断，提示检测血清circPVT1、miR-486-5p水平对NSCLC患者化疗疗效评估有一定价值，对临床制定NSCLC的治疗方案具有一定指导意义。

综上所述，NSCLC患者血清circPVT1表达水平升高，miR-486-5p表达水平降低，与晚期NSCLC患者放疗疗效有关，两者联合对放疗疗效有一定评估价值，可能成为评估化疗疗效的标志物。

参考文献

[1] MO Y，WANG Y，WANG Y，et al. Circular RNA circPVT1 promotes nasopharyngeal carcinoma metastasis via the β-TrCP/c-Myc/SRSF1 positive feedback loop［J］. Mol Cancer，2022，21（1）：192-211. doi：10.1186/s12943-022-01659-w.

[2] 高金霞，李秀元，牛莹莹，等. 原发性非小细胞肺癌中circPVT1的表达水平及诊断价值研究［J］. 中国医学创新，2021，18（31）：10-14. GAO J X，LI X Y，NIU Y Y，et al. Study on the expression level and diagnostic value of circPVTl in primary non-small cell lung cancer［J］. Medical Innovation of China，2021，18（31）：10-14. doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.31.003.

[3] HUANG M，LI T，WANG Q，et al. Silencing circPVT1 enhances radiosensitivity in non-small cell lung cancer by sponging microRNA-1208［J］. Cancer Biomark，2021，31（3）：263-279. doi：10.3233/CBM-203252.

[4] WANG A，ZHU J，LI J，et al. Downregulation of KIAA1199 by miR-486-5p suppresses tumorigenesis in lung cancer［J］. Cancer Med，2020，9（15）：5570-5586. doi：10.1002/cam4.3210.

[5] 蒋一玲，余洪金，张宁波，等. 大蒜素通过miR-486-5p/KDM5B轴增加非小细胞肺癌A549细胞放疗敏感性［J］. 温州医科大学学报，2022，52（5）：358-364. JIANG Y L，YU H J，ZHENG N B，et al. Mechanism of allicin in enhancing radiosensitivity of non-small cell lung cancer A549 cells via miR-486-5p/KDM5B axi［J］. Journal of Wenzhou Medical University，2022，52（5）：358-364. doi：10.3969/j.issn.2095-9400.2022.05.003.

[6] ARBOUR K C，RIELY G J. Systemic therapy for locally advanced and metastatic non-small cell lung cancer：a review［J］. JAMA，2019，322（8）：764-774. doi：10.1001/jama.2019.11058.

[7] HIGGINS K A，PURI S，GRAY J E. Systemic and radiation therapy approaches for locally advanced non-small-cell lung cancer［J］. J Clin Oncol，2022，40（6）：576-585. doi：10.1200/JCO.21.01707.

[8] 徐建群，王紅娟，郭红荣，等. 贝伐单抗结合培美曲塞与顺铂化疗对非小细胞肺癌患者血清lncRNA H19及lncRNA HOTAIR表达的影响［J］. 中国老年学杂志，2023，43（2）：283-287. XU J Q，WANG H J，GUO H R，et al. The effect of bevacizumab combined with pemetrexed and cisplatin chemotherapy on the expression of lncRNA H19 and lncRNA HOTAIR in serum of non-small cell lung cancer patients［J］. Chinese Journal of Gerontology，2023，43（2）：283-287. doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2022.02.008.

[9] XIE H Y，YAO J，WANG Y X，et al. Exosome-transmitted circVMP1 facilitates the progression and cisplatin resistance of non-small cell lung cancer by targeting miR-524-5p-METTL3/SOX2 axis［J］. Drug Deliv，2022，29（1）：1257-1271. doi：10.1080/10717544.2022.2057617.

[10] LI H，XUE S，ZHANG X，et al. CircRNA PVT1 modulated cell migration and invasion through Epithelial-Mesenchymal Transition（EMT） mediation in gastric cancer through miR-423-5p/Smad3 pathway［J］. Regen Ther，2022，21（1）：25-33. doi：10.1016/j.reth.2022.02.003.

[11] WANG J，HUANG K，SHI L，et al. CircPVT1 promoted the progression of breast cancer by regulating miR-29a-3p-mediated AGR2-HIF-1α pathway［J］. Cancer Manag Res，2020，12（1）：11477-11490. doi：10.2147/CMAR.S265579.

[12] ZHENG X，RUI S，WANG X F，et al. circPVT1 regulates medullary thyroid cancer growth and metastasis by targeting miR-455-5p to activate CXCL12/CXCR4 signaling［J］. J Exp Clin Cancer Res，2021，40（1）：157-174. doi：10.1186/s13046-021-01964-0.

[13] SHI J，LV X，ZENG L，et al. CircPVT1 promotes proliferation of lung squamous cell carcinoma by binding to miR-30d/e［J］. J Exp Clin Cancer Res，2021，40（1）：193. doi：10.1186/s13046-021-01976-w.

[14] MORO M，FORTUNATO O，BERTOLINI G，et al. MiR-486-5p targets CD133+ lung cancer stem cells through the p85/AKT pathway［J］. Pharmaceuticals （Basel），2022，15（3）：297. doi：10.3390/ph15030297.

[15] ABDALLAH R M，ELKHOULY A M，SOLIMAN R A，et al. Hindering the synchronization between miR-486-5p and H19 lncRNA by hesperetin halts breast cancer aggressiveness through tuning ICAM-1［J］. Anticancer Agents Med Chem，2022，22（3）：586-595. doi：10.2174/1871520621666210419093652.

[16] 龚立刚，艾成思，王梦萍. miR-486-5p靶向FOXO1抑制结肠癌干细胞干性的初步研究［J］. 安徽医科大学学报，2020，55（4）：528-533. GONG L G，AI C S，WANG M P. Preliminary study of miR-486-5p targeting FOXO1 inhibiting stemness of colorectal cancer stem cell［J］. Acta Universitatis Medicinalis Anhui，2020，55（4）：528-533. doi：10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2020.04.009.

[17] YAO W，WANG J，MENG F，et al. Circular RNA circPVT1 inhibits 5-fluorouracil chemosensitivity by regulating ferroptosis through MiR-30a-5p/FZD3 axis in esophageal cancer cells［J］. Front Oncol，2021，11：780938. doi：10.3389/fonc.2021.780938.

[18] LU H，XIE X，CHEN Q，et al. Clinical significance of circPVT1 in patients with non-small cell lung cancer who received cisplatin combined with gemcitabine chemotherapy［J］. Tumori，2021，107（3）：204-208. doi：10.1177/0300891620941940.

[19] LUO Z，CHEN R，HU S，et al. PVT1 promotes resistance to 5-FU in colon cancer via the miR-486-5p/CDK4 axis［J］. Oncol Lett，2022，24（2）：280. doi：10.3892/ol.2022.13400.

（2023-03-15收稿 2023-05-13修回）

（本文編辑 李鹏）