内镜联合康复新液治疗对肝硬化食管胃底静脉曲张患者口腔和肠道菌群的影响

任海霞,李淑霞,郭永泽,平付敏,牛淑利,王建华,郭晓会,闫华楠

(1. 河北工程大学附属医院,河北 邯郸 056000;2. 河北工程大学临床医学院,河北 邯郸 056000)

肝硬化失代偿期的患者常发生腹水、肝性脑病、食管胃底静脉曲张出血等并发症。其中食管胃底静脉曲张出血最为严重,根据2019年《肝硬化诊治指南》[1]推荐,临床上二级预防的一线治疗首推内镜联合药物干预。目前的内镜技术包括食管胃底曲张静脉套扎术、硬化剂注射术和组织胶注射术,注射硬化剂可以损伤血管内皮,进一步引起静脉内膜炎、血栓形成[2],最后曲张静脉逐渐机化直至消失;组织胶与血液会迅速固化,也可产生局部炎症,使血管纤维化[3]。康复新液为中成药,来源于美洲蟑螂体内的有效成分,有通利血脉、养阴生肌的功效[4]。从上个世纪开始,有关肝脏疾病与菌群改变的研究不断深入,逐渐形成了口腔-肠-肝轴理论,目前关于内镜联合康复新液干预对肝硬化食管胃底静脉曲张患者口腔和肠道菌群是否有影响尚不明确,本研究通过测序肝硬化食管胃底静脉曲张患者经内镜联合康复新液治疗前后的唾液样本和粪便样本,分析了内镜联合康复新液治疗对口腔和肠道菌群影响,现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1研究对象 选择2021年6月—2022年9月在河北工程大学附属医院、邯郸市传染病医院择期接受内镜联合康复新液治疗的肝硬化食管胃底静脉曲张患者17例作为研究对象,男11例,女6例;谷丙转氨酶(ALT)29.20(22.10,41.75)IU/L,谷草转氨酶(AST)29.90(26.35,34.60)IU/L,总胆红素(TBil)24.30(16.70,34.30)μmol/L,直接胆红素(DBil)7.70(5.10,11.40)μmol/L,间接胆红素(IBil)16.60(10.60,22.30)μmol/L,白蛋白(ALB)(39.45±5.18)g/L,凝血酶原时间(PT)14.90(13.00,16.05)s。患者均符合《肝硬化诊治指南》[1]中肝硬化食管胃底静脉曲张诊断标准。排除伴其他系统重大疾病及恶性肿瘤者;有牙科病史和口腔检查发现任何有活动性牙龈或牙周病者;合并慢性腹泻、炎症性肠病等可引起肠道菌群紊乱的患者;有胃肠道手术史者;1个月内使用过抗生素及益生菌者。本研究通过了河北工程大学附属医院伦理委员会的审核,且所有参与的患者均已知情同意。

1.2样本采集 分别于内镜联合康复新液治疗前1～3 d共收集唾液17份、粪便17份,治疗3 d后、治疗7 d后各收集唾液样本17份、粪便样本17份。

1.2.1唾液采集 所有研究对象至少在样本收集2 h前不进食、不饮水、不刷牙。在收集过程中,受试者手拿无菌、无酶收集管,口含唾液至少1 min,随后使唾液流入试管中,收集量2～5 mL,2 h内送至实验室-86 ℃冰箱保存。

1.2.2粪便采集 用粪便取样器留取粪便中段里部50～100 mg样本,每样留存2～3管备份,2 h内放入-86 ℃超低温冰箱保存,采集管要求无菌、密封,采集过程中避免尿液等污染。

1.3DNA提取、16S rRNA基因文库制备及信息分析 将唾液和粪便样本放入裂解液中裂解离心,得到样品DNA进行NanoDrop样品浓度检测和1%琼脂糖凝胶样品完整性检测。取唾液或粪便样品与融合扩增引物配置PCR反应体系进行扩增后,用Agencourt AMPure XP 磁珠进行纯化,溶于Elution Buffer内,文库构建完成。使用Agilent 2100 Bioanalyzer仪器检测文库片段的浓度和总量片段大小。检测合格的样本pooling后,采用Illumina Hiseq 2500测序仪进行测序,测序类型为PE300,测序得到的Raw data经过过滤获得Clean data。通过reads之间的互相重叠关系将reads拼接成Tags,聚类成OTU并与数据库比对、物种注释;基于OTU和注释结果进行样品物种分析。

2 结 果

2.1OTU聚类花瓣图 3个时间点检测的唾液和粪便样本中共同拥有不重复的137个OTU,治疗前唾液独有40个OTU,治疗3 d后唾液拥有5个不重复OTU,治疗7 d后唾液独有34个OTU;治疗前粪便独有11个OTU,治疗3 d后粪便独有75个OTU,治疗7 d后粪便独有6个OTU。见图1。

图1 肝硬化食管胃底静脉曲张患者治疗前后唾液、粪便OTU统计的花瓣图

2.2唾液、粪便部分物种相对丰度 在唾液样本中,3个时间点检测的韦荣球菌属在治疗后丰度处于上升趋势,而梭杆菌属、嗜血杆菌属、颗粒链菌属、巨球形菌属则处于逐渐下降的趋势。3个时间点检测的粪便样本中普氏菌属比较差异有统计学意义(P均<0.05),治疗前和治疗7 d后比较差异有统计学意义(P=0.026);韦荣球菌属、布劳特菌属、颤螺旋菌属呈现出逐渐上升的变化,巨球形菌属、梭杆菌属在治疗后出现下降的趋势,但差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 肝硬化食管胃底静脉曲张患者治疗前后唾液、粪便属水平上部分优势菌群相对丰度 %

2.3唾液样本GraPhlAn 物种组成图 由图2可见,从门水平上分析,3个时间点检测的唾液、粪便样本中的优势菌群为Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)和Proteobacteria(变形菌门)等。3个时间点检测的唾液样本中的优势菌属是拟杆菌门中的Prevotella(普氏菌属),其次是厚壁菌门中的Veillonella(韦荣球菌属)。3个时间点检测的粪便样本从属水平上分析,丰度由大到小依次是Bacteroides(拟杆菌属)、FaecaliBacterium(粪杆菌属)、Escherichia(埃希杆菌属)、Prevotella(普氏菌属)等。

图2 肝硬化食管胃底静脉曲张患者治疗前后唾液、粪便样本GraphlAn图

2.4Alpha多样性分析 3个时间点检测的唾液、粪便样本间Ace、Shannon指数比较差异均无统计学意义(P均>0.05),但各时间点唾液样本Ace指数的均数呈现出先下降后上升的趋势,且治疗7 d后的指数要高于治疗前;3个时间点检测的粪便标本间Ace、Shannon指数的均数(中位数)呈现出先下降后上升的趋势,且治疗7 d后的数值要稍高于治疗前,说明内镜联合康复新液治疗后肠道菌群多样性有升高的趋势。见表2。

表2 肝硬化食管胃底静脉曲张患者治疗前后唾液、粪便菌群多样性指数比较

2.5粪便标本菌群分型分析 3个时间点检测的粪便样本被聚类为三类肠型,其中治疗前和治疗7 d后粪便标本绝大多数聚集在肠型1,治疗3 d后粪便标本主要聚集在肠型2和肠型3。见图3。

图3 肝硬化食管胃底静脉曲张患者治疗前后粪便标本菌群分型分析图

3 讨 论

本研究采用同一批肝硬化食管胃底静脉曲张患者经内镜联合康复新液治疗前后患者的唾液样本和粪便样本,它们拥有共同的137个OTU。经内镜联合康复新液治疗后口腔菌群丰度有增加的趋势。从属水平上可见3个时间点检测的唾液中物种相对丰度占前两位的是普氏菌属和韦荣球菌属,颗粒链菌属、巨球形菌属均处于下降的态势。颗粒链菌属属于人类口腔常见的优势菌,无动力、不形成芽孢的革兰阳性球菌,除了与口腔疾病有密切关系外,还与机体多系统疾病有关联[5]。加州大学一项关于30例肝硬化患者的研究发现,颗粒链菌属在肝硬化合并肝性脑病的患者中比肝硬化无肝性脑病的患者增加3.1倍[6]。国外关于健康人和患有牙周疾病人群的口腔微生物高通量测序发现,患有牙周疾病的人口腔中含有大量的巨球形菌属[7]。Bajaj等[8]发现在肝性脑病与肝硬化未合并肝性脑病的粪便微生物无差别,可在肝性脑病患者的乙状结肠黏膜中发现巨球形菌属异常存在。这两种致病菌属相对丰度在治疗后处于下降趋势,说明内镜联合康复新液治疗对患者的口腔环境有改善作用。

对治疗前后粪便样本进行Alpha多样性分析发现,内镜联合康复新液治疗对肠道菌群的多样性产生了影响。属水平上,3个时间点检测的粪便样本中普氏菌属相对丰度构成上具有明显的差异,巨球形菌属、梭杆菌属等处于依次下降的走向,布劳特菌属、颤螺旋菌属处于上升的趋势。布劳特菌属是一类厌氧型、发酵分解有机营养物质的菌群,可利用氢气和二氧化碳作为主要能源,它的葡萄糖代谢产物包括乙酸酯、乙醇、氢、乳酸和琥珀酸,具有7-α去羟基化的作用,使初级胆汁酸代谢为次级胆汁酸。研究发现肝硬化患者肠道环境由微生物和消化器官分泌的因子相互作用,比如胆汁酸的代谢,Durand等[9]发现晚期肝硬化患者肠道内的布劳特菌属相对丰度降低,晚期肝硬化患者比早期肝硬化患者和健康人的次级胆汁酸/初级胆汁酸的比率要低。

粪便样本被聚类为三类肠型,每种肠型会发生不同的功能变异[10]。肠型1富含具有糖分解能力的拟杆菌属,而且编码降解碳水化合物和蛋白质的消化酶基因也在这种肠型中富集[11]。肠型2富含普氏菌属和脱硫弧菌属,普氏菌属是一种已知的黏蛋白降解菌,而脱硫弧菌属可以通过去除硫酸盐来加强黏蛋白脱硫步骤,两者协同可以降解肠黏膜层的黏蛋白和糖蛋白[12]。肠型3主要富含可降解黏蛋白的瘤胃球菌属和阿克曼菌属,也富含膜转运蛋白,这暗示这些菌属的存在可以吸收由黏蛋白结合随后水解产生的单糖[13]。本研究发现治疗前和治疗7 d后粪便标本绝大多数聚集在肠型1,治疗3 d后粪便标本主要聚集在肠型2和肠型3,可见探究内镜联合康复新液治疗不同阶段的肠道菌群肠型有助于预测菌群的功能,为使用益生菌干预肠道功能提供新的方向。

食管胃底静脉曲张可影响胃黏膜血液循环,被输送到肝脏的毒素不能被及时清除,食管下端括约肌解剖结构受到影响,胃内的食物反流入食管损伤食管黏膜[14-15];肝硬化患者易产生的高胃泌素血症致幽门括约肌功能下降,胆汁随食物进入胃内造成胃黏膜损伤。在众多的因素作用下,患者的肠道屏障受到损伤,菌群的稳定受到干扰。本研究发现经内镜联合康复新液治疗后,肝硬化食管胃底静脉曲张患者曲张的血管闭塞,肠道血运和功能得到改善,有益菌群比例上升,有害菌群的相对丰度下降,口腔环境和肠道微生物屏障存在恢复的趋势。

本研究创新处是利用口腔-肠-肝轴分析内镜联合康复新液治疗前后口腔和肠道菌群的变化,不足之处在于样本容量和选择样本的时间周期短,所以计划进一步扩大样本量和延长标本采集的时间,分析更多的数据研究内镜联合康复新液治疗前后口腔和肠道菌群的变化,为将来治疗食管胃底静脉曲张提供微生物干预措施和预测内镜联合康复新液治疗效果提供方案。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。