止痛健骨方对兔膝骨关节炎关节软骨Wnt5a表达的影响及Wnt5a与软骨T2值的相关性研究

刘音其,罗慕晴,黎建宇,高 辉,何业文,李 平,沈宏荣,钟泽亚,张 堃

(1. 湖南中医药大学第一附属医院,湖南 长沙 410007;2. 湖南中医药大学中西医结合学院,湖南 长沙 410208)

膝骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)又称膝退行性骨关节病,是一种病因不明的退行性关节病变,老年女性发病率较高,临床表现主要包括疼痛、活动受限及关节畸形等,病理学上主要以关节软骨损伤为主[1-3]。Wnt/β-catenin通路参与骨及软骨细胞分化、增殖和凋亡调控过程,该通路活化或抑制均可能导致骨性关节炎,是骨性关节炎关节软骨破坏进程中最重要的通路[4-6]。近期研究表明,Wnt家族蛋白中Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a、Wnt7b等与骨性关节炎关节软骨病变关系较为密切[7],其中Wnt5a可以激活Wnt/β-catenin通路,导致炎症介质释放增加,加重软骨损伤和炎症反应,加速骨关节炎的进程[8-9]。止痛健骨方具有活血祛痰、通络止痛、强筋健骨的功效,既往研究证实该方可增加KOA模型兔膝关节活动度,延缓软骨损伤[10]。T2 mapping成像能对早期软骨病变进行非侵入性、精确的诊断[11-12],有助于骨性关节炎早期诊断、疾病进展监测及疗效评估[13-15]。本研究旨在通过观察止痛健骨方对兔KOA关节软骨Wnt5a表达的影响及关节软骨Wnt5a含量与T2值的相关性,探讨 T2 mapping成像评估止痛健骨方治疗兔KOA关节软骨损伤疗效的可行性。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 清洁级新西兰健康成年大白兔32只,雌雄各半,月龄2～3个月,体重1.68～2.35(2.03±0.16)kg,由长沙市天勤生物技术有限公司提供,动物许可证号:SCXK(湘)2015-0008。所有白兔单笼常规饲养,自由摄水,保持12 h昼夜轮替及恒温环境。研究经过湖南省中医药研究院伦理委员会批准(伦理审查备案号:2017-0021)。

1.2主要药物、试剂与仪器 止痛健骨方由当归12 g、白芥子(炒)12 g、丹参105 g、猪牙皂1.5 g、鹿角霜7.5 g、鳖甲7.5 g、黄芪9 g、乳香(醋制)7.5 g、独活3 g、千年健9 g、陆英9 g组成,药物均从湖南中医药研究院附属医院一次性购入,依据临床研究批件规定的制剂工艺及质量标准生产干膏粉以备实验用(每克含生药3.353 g,批号:20170701),依据前期药效学实验确定最佳剂量为2.98 g(生药量)/(kg·d)。硫酸氨基葡萄糖(浙江海正药业,批号:GSCy1008)。无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司);二甲苯(国药集团化学试剂有限公司);柠檬酸(pH6.0)抗原修复液(Servicebio);磷酸盐缓冲液(PBS,Servicebio);3%双氧水(Servicebio);苏木素染液、分化液及返蓝液(Servicebio);中性树胶(Servicebio)。脱水机(武汉俊杰电子有限公司),病理切片机(上海徕卡仪器有限公司),医用高分子固定绷带(苏州元康医疗器械有限公司,医疗器械产品备案号:苏械备20142058号),一次性使用无菌注射器(山东威高集团医用高分子制品有限公司,规格:1 mL和10 mL)。

1.3实验方法 32只白兔适应性饲养1周后随机分为正常组、模型组、硫酸氨基葡萄糖组和止痛健骨方组,每组8只。除正常组外,其余组白兔均采用改良伸直制动法[16]建立KOA模型:将白兔斜卧位固定于实验台,向后上方拉直右下肢,同侧踝关节保持正常生理曲度;去毛并用医用碘伏消毒皮肤(范围为右髋关节至右踝关节);用绷带和医用胶带将压舌板固定于右下肢内侧(压舌板上缘距髋关节1～2 cm,下缘超过踝关节),以重叠1/2螺旋状方法依次缠绕多层纱布和4层医用高分子固定绷带,保持踝关节呈“L”型,角度为120°～150°(范围为髋关节至踝关节以下4～5 cm,远端脚趾裸露);等待管型定型(4～5 min)并确定姿势固定满意,管型位置、形态符合要求后将实验兔放回兔笼。制动2周(此过程中3个造模组各有2只兔死亡)后,止痛健骨方组给予止痛健骨方2.98 g(生药量)/(kg·d)灌胃,硫酸氨基葡萄糖组给予硫酸氨基葡萄糖0.088 g/(kg·d)(依据人-兔等效剂量折算公式[17]计算,用适量蒸馏水配比)灌胃,正常组和模型组给予蒸馏水灌胃,灌胃容积均为10 mL/(kg·d),均1次/d,连续灌胃4周。

1.4检测指标及方法

1.4.1MR检查及图像处理 末次灌胃结束后,采用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)经耳缘静脉注射麻醉各组兔,行右膝关节MR扫描(GE HDxT Signa 3.0 T,动物膝关节线圈)。扫描前采用硬板和透明胶将兔双下肢固定成膝关节尽量伸直状态,仰卧位,腿先进。矢状位T1WI序列:TR/TE=550/12 ms,FOV=16 cm,矩阵256×256,层厚3 mm,层间隔0 mm;矢状位和冠状位脂肪抑制快速自旋回波质子加权序列:TR/TE=3 000/13 ms,FOV=16 cm,矩阵256×256,层厚3 mm,层间隔0 mm;矢状位T2-Mapping序列:TR 1 100 ms,TE取9 ms、18 ms、27 ms、36 ms、45 ms、54 ms、63 ms、72 ms,FOV 16 cm×16 cm,矩阵256×256,层厚3 mm,层间隔0 mm。采用Functool软件对图像进行后处理获得T2 mapping伪彩图,由2名具有5～10年骨骼肌肉影像诊断经验的放射科主治及以上医师,分别根据矢状面和冠状位质子加权像三维定位和参考大体病理关节软骨病变区域确定右侧股骨内侧髁关节软骨病变区域、放置感兴趣区(ROI)并测量T2值,ROI大小约为1.3 mm2(设置ROI时注意避开非软骨区域,保持ROI大小和形状一致),最终取两者的平均值行后续分析。

1.4.2膝关节软骨损伤情况 完成MRI扫描的24 h内,将全部白兔进行空气栓塞,取出右膝关节股骨内侧髁,肉眼观察确定软骨病变最严重的区域并行切片保存。对关节软骨行番红固绿染色:石蜡切片脱蜡、水化;苏木精染色5 min并蒸馏水冲洗10 min;1%盐酸酒精分化15 s并蒸馏水冲洗3 min;0.02%固绿水溶液染色3 min;1%冰醋酸洗涤切片;0.1%番红染色5 min,95%乙醇浸洗并脱水封片。通过光学显微镜观察软骨基质中的蛋白聚糖进而评估关节软骨损伤情况。

1.4.3膝关节软骨中Wnt5a表达情况 采用免疫组化法对关节软骨内Wnt5a表达情况进行半定量测定:石蜡片脱蜡、水化;柠檬酸抗原修复缓冲液进行抗原修复;放入3%双氧水溶液中消除内源性酶,磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)脱色后进行血清封闭;在切片上滴加按一定比例配好的Wnt5a一抗50 μL(英国Abcam有限公司,批号:Ab174963),平放于湿盒内4 ℃孵育过夜;切片孵育过夜后37 ℃复温45 min,PBS冲洗,3 min×3次;滴加50 μL与一抗相应种属二抗,室温孵育15 min,PBS冲洗,3 min×3次;充分显色后,自来水冲洗切片终止显色;苏木紫复染细胞核并脱水封片。采用Image J软件,对每张组织切片200倍视野病变区随机设置6个ROI,计算每个ROI的平均光密度值(AOD),最终取6个ROI的AOD的平均值用于后续分析。

1.5统计学方法 采用SPSS 25.0软件(IBM Corp.,Armonk,NY,USA)进行统计学分析。经正态性和方差齐性检验后,本实验计量资料为偏态分布,以M(Q1,Q3)形式表示,采用Kruskal-Wallis H检验行多组间比较,再用Mann-WhitneyU检验进行两两比较。应用Spearman相关分析评价关节软骨Wnt5a表达量与T2值的相关性。计算组内相关系数(ICC)及95%CI评价2名医师在定量评估中的测量者间一致性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1测量者间的一致性 2名影像医师测量兔右膝股骨内侧髁关节软骨T2值的ICC(95%CI)为0.956(0.854～0.983),P<0.05,说明评估指标具有极好的一致性。

2.2各组白兔右膝关节软骨T2值及MR T2 mapping伪彩图比较 正常组、模型组、止痛健骨方组和硫酸氨基葡萄糖组关节软骨的T2值分别为42.07(41.25,42.63)ms、54.99(53.47,61.52)ms、51.67(49.80,53.04)ms、51.05(48.59,51.97)ms,各组关节软骨T2值总体比较差异有统计学意义(P均<0.05),其中模型组、止痛健骨方组、硫酸氨基葡萄糖组均明显高于正常组(Z=3.712,P<0.001;Z=3.846,P<0.001;Z=3.965,P<0.001),止痛健骨方组、硫酸氨基葡萄糖组均明显低于模型组(Z=3.185,P=0.001;Z=3.387,P=0.001),止痛健骨方组与硫酸氨基葡萄糖组比较差异无统计学意义(Z=1.065,P=0.287)。T2 mapping伪彩图显示,正常组呈现较均匀的蓝色色阶,模型组蓝色色阶消失而代之以黄绿色色阶,硫酸氨基葡萄糖组和止痛健骨方组黄绿色色阶范围缩小,见图1。

图1 正常组和膝骨关节炎各组白兔膝关节软骨MR T2 mapping伪彩图

2.3各组白兔右膝关节软骨损伤情况 正常组关节表面光滑,番红素均匀分布,软骨细胞完整,排列正常;模型组、硫酸氨基葡萄糖组、止痛健骨方组番红蛋白染色明显减少,细胞间基质及软骨层有不同程度的破坏或丢失;与模型组比较,硫酸氨基葡萄糖组、止痛健骨方组番红蛋白染色程度深,细胞间基质及软骨层破坏较轻。见图2。

图2 正常组和膝骨关节炎各组白兔膝关节软骨组织番红固绿染色形态(×200)

2.4各组白兔右膝关节软骨中Wnt5a表达情况比较 免疫组化染色显示,正常组软骨中Wnt5a 阴性表达,模型组呈强阳性表达,硫酸氨基葡萄糖组和止痛健骨方组阳性表达较模型组明显减少,见图3。 正常组、模型组、止痛健骨方组和硫酸氨基葡萄糖组关节软骨中Wnt5a表达平均光密度值分别为0.000(0.000,0.000)、0.045(0.035,0.051)、0.013(0.008,0.015)、0.001(0.001,0.001),各组关节软骨中Wnt5a表达平均光密度值总体比较差异有统计学意义(P均<0.05),其中模型组、止痛健骨方组、硫酸氨基葡萄糖组均明显高于正常组(Z=4.184,P<0.001;Z=4.258,P<0.001;Z=4.325,P<0.001),止痛健骨方组、硫酸氨基葡萄糖组均明显低于模型组(Z=3.475,P=0.001;Z=3.565,P<0.001),止痛健骨方组明显高于硫酸氨基葡萄糖组(Z=3.686,P<0.001)。

图3 正常组和膝骨关节炎各组白兔膝关节软骨中Wnt5a表达情况(免疫组化染色,×200)

2.5关节软骨中Wnt5a表达量与软骨T2值相关性 根据关节软骨中Wnt5a表达量与T2值绘制散点图(见图4),提示关节软骨中Wnt5a表达量与T2值无直线趋势;Spearman相关分析显示随着Wnt5a表达量增加,对应关节软骨T2值上升,两者呈直线强正相关(r=0.884,P<0.05)。

图4 白兔膝关节软骨中Wnt5a表达量与T2值散点图

3 讨 论

骨性关节炎发病率高且病因不明,其核心病变为关节软骨损伤,而关节软骨损伤以细胞外基质Ⅱ型胶原(collagen Ⅱ, COL2)破坏为主[18-19]。Wnt信号通路可以影响关节的发育和动态平衡,在骨关节炎等疾病中起着关键作用[20-22]。关节软骨缺乏血管、神经和淋巴结,是一种致密的结缔组织[23],软骨细胞是成人关节软骨中唯一的细胞群,具有再生正常软骨基质的能力,随着年龄增长其再生能力逐渐下降,骨性关节炎关节软骨损伤几乎无法自我修复[24],因此早期诊断关节软骨损伤极其重要。关节镜检查是诊断膝关节软骨损伤的金标准,但其为有创检查。常规MR对早期软骨损伤观察有限。近年来多种MR功能序列可实现对关节软骨损伤的定量评估,其中T2 mapping成像应用最广泛,通过对关节软骨中含水量及胶原纤维的含量和分布进行检测[25-26],有助于早期诊断关节软骨损伤及评估药物对软骨修复的疗效[27-28]。本实验结果显示,与正常组比较,模型组、硫酸氨基葡萄糖组、止痛健骨方组兔膝关节软骨T2值均明显增高,病理观察显示软骨层破坏,提示KOA关节软骨细胞外基质的成分发生了改变,验证了T2 mapping成像可定量评估关节软骨损伤,这与Banitalebi等[15]研究结果相符;硫酸氨基葡萄糖组、止痛健骨方组兔膝关节软骨T2值较模型组低,病理观察显示软骨层破坏较模型组轻,说明T2 mapping成像可评估药物治疗KOA关节软骨损伤的疗效。

既往研究表明,Wnt5a蛋白的过度表达与KOA关节软骨损伤有密切的相关性[8],Wnt5a可在白细胞介素-1β诱导下促进基质金属蛋白酶表达,导致COL2降解和破坏[29-32]。本实验结果显示,模型组兔膝关节软骨中Wnt5a表达量明显高于正常组,止痛健骨方组兔膝关节软骨中Wnt5a表达量明显低于模型组,也证实Wnt5a过表达与KOA关节软骨损伤密切相关,同时提示止痛健骨方可能通过下调Wnt5a表达而减轻KOA关节软骨损伤。相关性分析显示,兔膝关节软骨中Wnt5a表达量与T2值呈强正相关,即T2值能够反映关节软骨中Wnt5a的表达量,T2值越高软骨中Wnt5a表达量越大,提示T2 mapping成像具有无创评估关节软骨中Wnt5a表达情况的潜力。

综上所述,止痛健骨方对骨性关节炎软骨的保护作用可能是通过下调Wnt5a表达实现的,T2 mapping成像与关节软骨中Wnt5a的表达有较好的相关性,有助于无创评估止痛健骨方治疗兔KOA关节软骨损伤的疗效,为临床中评估膝骨关节炎的治疗效果提供了新的切入点。但本研究存在一定局限性:①关节软骨退变是多种因素造成的结果,本研究未对所有软骨病理生化指标进行分析,后续将继续探索其他关节软骨病理生化指标与T2 mapping成像的相关性;②本研究T2 mapping后处理伪彩图ROI的选取存在一定主观误差;③止痛健骨方不同剂量对关节软骨Wnt5a表达的调控及止痛健骨方内的有效作用成分本研究并未涉及,今后需扩大样本量行进一步验证。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。