湿润烧伤膏对大鼠肛瘘术后创面模型愈合及TNF-α、IL-1β表达的影响

鲍新坤,张晓雨,肖文洁,孙光军,林爱珍

(湖北省中医院,湖北 武汉 430061)

肛瘘又名肛门直肠瘘,多为肛门直肠周围间隙脓肿破溃或引流后形成,是结直肠肛门外科领域中常见的疾病之一[1]。本病易反复发作,主要以手术治疗为主。目前,肛瘘术后创面愈合时间长,排便和换药时的剧烈疼痛,远期瘢痕形成导致的肛门狭窄和失禁等成为困扰医患双方的重大问题,如何有效促进肛瘘术后创面愈合、缩短创面的愈合时间是临床医生亟须攻克的难题之一。近年来,肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 、白细胞介素-1β(IL-1β)等炎症因子的异常表达在创面修复中的影响受到广泛关注[2]。有研究表明,湿润烧伤膏可通过激活转化生长因子β1/Smad家族成员3信号通路,有效抑制白细胞介素-6(IL-6)等炎症因子的表达,从而促进烧伤创面愈合[3]。谭伟能[4]和汪明[5]报道,湿润烧伤膏用于肛瘘术后换药,可明显减轻患者术后疼痛,减少术后瘢痕形成,缩短创面愈合时间,但具体分子机制尚未明确。本研究通过动态监测肛瘘术后大鼠创面组织愈合情况及创面组织中TNF-α、IL-1β含量,探讨了湿润烧伤膏促进创面愈合的作用机制,以为临床应用湿润烧伤膏促进肛瘘术后创面愈合提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 30只SPF级SD雄性大鼠,6～8周龄,体重(200±20)g,由湖北省疾病预防控制中心动物中心提供。大鼠饲养于湖北中医药大学医学实验中心,饲养的环境符合国标(GB14925-2010)SPF级实验动物所需的标准,室温控制在22～24 ℃,相对湿度40%～60%,每日定时更换饲料,自由摄食饮水。

1.2药物及菌株 湿润烧伤膏(汕头市美宝制药有限公司,规格:60 g/支),易孚[重组人表皮生长因子凝胶(酵母),桂林华诺威基因药业有限公司,规格:20 g/支],生理盐水(湖南科伦制药有限公司,规格:500 mL/瓶),金黄色葡萄球菌大肠杆菌混合菌液(湖北中医药大学肠道微生态实验室提供)。

1.3主要试剂与仪器 伊红Y(国药集团,71014544);中性树胶(国药集团,10004160);苏木素(Sigma,H9627);TNF-α(ABclonal,A11534);IL-1β(三鹰,21865-1-AP);离心机(H1650-W,湘仪);电热恒温培养箱(ICV-450,日本ASONE);FlexStation 3多功能酶标仪(Flexstation3,Molecular Devices)。

1.4实验方法 所有大鼠均先进行适应性喂养7 d,然后按照随机数字表法分为湿润烧伤膏组、易孚组及生理盐水组,每组10只。3组均参考文献[6]方法建立肛瘘术后创面:对手术区域进行备皮,用5%水合氯醛溶液(0.007 mL/g)腹腔注射麻醉大鼠后,用碘伏消毒手术区域,剪除边长约为3.0 cm的方形皮肤,创面深至肌层。伤口淋洒金黄色葡萄球菌大肠杆菌混合菌液,创面部位敷以创面相应大小的油纱敷料,用纱布包扎止血,24 h后去除纱布和敷料。每日伤口淋洒金黄色葡萄球菌大肠杆菌混合菌液0.2 mL,72 h后见伤口有脓性分泌物,渗液较多,创缘皮色发红,类似于临床肛瘘术后“急性、开放、渗血、感染”的创面,提示造模成功。造模成功后,每日下午定时对3组大鼠创面进行换药1次,换药时湿润烧伤膏组创面外敷湿润烧伤膏0.2 mL,易孚组创面外敷易孚凝胶0.2 mL,生理盐水组创面外敷生理盐水0.2 mL。

1.5观察指标及方法

1.5.1创面愈合情况 分别于换药第3,7,14天,肉眼观察创面颜色、肉芽生长、分泌物渗出、结痂等情况,并拍照记录创面愈合情况。每组大鼠各随机选取3只(共9个创面),用透明薄膜紧密敷贴于创面上,用较细记号笔画出伤口的边缘,然后将透明薄膜平铺在ECG纸上,计算出创面面积,创面愈合率=(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积×100%。

1.5.2创面组织病理学形态 换药第14天麻醉所有大鼠,在无菌条件下取创面中心至创缘正常皮肤间的新生肉芽组织,洗去表面血液后固定于10%中性福尔马林溶液中。将提取的新生肉芽组织经过脱水、透明、石蜡包埋制成蜡块,用病理切片机进行切片,切好的组织片放入40 ℃的水浴锅中进行摊片,切片用二甲苯脱蜡、苏木精-伊红染色5 min、自来水浸洗30 s、乙醇梯度脱水,风干后中性树胶封片,最后显微镜(×100)下观察创面组织的病理学形态。

1.5.3创面组织中TNF-α、IL-1β含量 换药第14天,提取并准确称取创面组织30 mg,加入800 μL预冷PBS冲洗组织表面血液。将洗净后的组织放入600 μL预冷PBS匀浆机匀浆至无明显组织颗粒,低温离心后取上清。将上清放入-40 ℃冰箱冻融,此过程重复2次。按BCA定量方法进行蛋白定量至统一浓度。严格按照ELISA试剂盒说明书测定TNF-α、IL-1β含量,用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行半定量分析。

2 结 果

2.13组大鼠创面愈合情况 换药第3天,生理盐水组大鼠创面局部可见少许分泌物,颜色相对黑暗;易孚组大鼠创面边缘可见少许肉芽组织增生;湿润烧伤膏组大鼠局部可见皮纹增生,表面少许痂皮覆盖,局部组织较干燥。换药第7天,湿润烧伤膏组创面修复面积均明显大于生理盐水组与易孚组。换药第14天,3组大鼠创面局部边缘均可见毛发覆盖,易孚组局部少许渗出,湿润烧伤膏组局部组织干燥,且湿润烧伤膏组创面明显小于生理盐水组与易孚组。见图1。

图1 3组肛瘘术后创面模型大鼠换药第3,7,14天肉眼观察创面愈合情况

2.23组大鼠创面愈合率比较 换药第3天,3组大鼠创面愈合率比较差异均无统计学意义(P均>0.05);换药第7天和第14天,湿润烧伤膏组和易孚组大鼠创面愈合率均明显高于同期生理盐水组(P均<0.05),且湿润烧伤膏组均明显高于同期易孚组(P均<0.05)。见表1。

表1 3组肛瘘术后创面模型大鼠换药后不同时间点创面愈合率比较

2.33组大鼠创面组织病理形态比较 换药第14天,生理盐水组大鼠创面组织出现大量炎症细胞聚集、浸润,少量纤维和胶原蛋白沉积,创面形成肉芽组织;易孚组大鼠创面组织炎性细胞较生理盐水组明显减少,局部可见红细胞溢出血管壁外,大量胶原蛋白沉积,肉芽组织增多;湿润烧伤膏组大鼠创面组织炎性细胞较易孚组明显减少,胶原组织清晰可见并排列整齐,创面肉芽组织生长明显。见图2。

图2 3组肛瘘术后创面模型大鼠换药第14天创面组织病理形态(HE染色,×200)

2.43组大鼠创面组织中TNF-α、IL-1β含量比较 换药第14天,湿润烧伤膏组和易孚组大鼠创面组织中TNF-α、IL-1β含量均明显低于生理盐水组(P均<0.05),且湿润烧伤膏组TNF-α、IL-1β含量均明显低于易孚组(P均<0.05)。见表2。

表2 3组肛瘘术后创面模型大鼠换药第14天创面组织中TNF-α、IL-1β含量比较

3 讨 论

由于肛门排便的特殊性,肛瘘易慢性迁延难愈,多需要手术治疗。目前大多数肛瘘手术采取开放性切开引流,术后创面疼痛、感染和愈合速度等与术后换药关系密切[7],若伤口愈合不良可增加再次手术的风险,严重影响患者身心健康。现代医学认为,创面修复主要包括炎症反应、肉芽增殖、组织重塑3个阶段,其中创面炎症水肿、血管生成以及上皮化异常、肉芽组织过度增生等是影响创面愈合过程中的主要因素,因此维持一个良好的伤口环境及状态在创面修复中至关重要[8]。

中医学认为,肛瘘手术时肛周组织同时为金刃所伤,形成溃疡创面,余邪未尽,气滞血瘀,两邪客留经络,经络受阻,气血不畅,致溃疡面失于荣养,脓腐难祛,新肉难生,病程迁延不愈。治疗上宜采用祛邪、化瘀、补虚等手段调和气血,从而促进溃疡面修复[9-10]。湿润烧伤膏是由黄连、黄柏、黄芩、地龙、罂粟壳等药材制成的中药膏,外用于创伤、溃疡久不收口具有较好的治疗效果。相关研究报道,湿润烧伤膏外用可给创面提供充分的氧供和营养物质,刺激创面新生肉芽组织中大量的血管生成,机制可能与调控抵抗素样分子α(RELM-α)表达、活化PI3K/Akt/eNOS信号通路有关[11-12]。本实验结果显示,湿润烧伤膏组大鼠换药第7天和第14天的创面愈合率均明显高于生理盐水组和易孚组,病理观察显示创面组织炎性细胞明显减少,大量胶原蛋白沉积,表明湿润烧伤膏可以有效促进大鼠肛瘘术后创面模型的愈合。

术后创面修复是一个复杂、多步骤的过程,其中炎症反应的程度是影响创面愈合速度的主要因素[13-14]。机体各类炎症反应与炎症因子的参与密切相关,在免疫应答的急性期主要由TNF-α、IL-6和IL-1β等因子介导,这也是研究中医药治疗干预各种感染性炎症所涉及的常见效应靶点[15]。TNF-α是主要由活化的单核巨噬细胞产生的一种多功能Th1细胞因子[16],当机体受到损伤和刺激后会迅速释放TNF-α,激发宿主防御机制,并趋化其他免疫细胞清除创面感染[17-18]。IL-1β由多种细胞合成并分泌,早期可介导机体免疫反应,参与局部抗炎并吞噬及清除坏死组织[19]。既往研究表明,中药治疗能参与巨噬细胞介导的炎症反应,调节机体抗感染能力,抑制炎症损伤,促进受损组织的修复和血管生成,从而促进创面愈合[20-21]。本实验结果显示,湿润烧伤膏组换药第14天创面组织内TNF-α、IL-1β含量明显低于生理盐水组及易孚组,提示湿润烧伤膏可以通过降低TNF-α、IL-1β含量,减轻大鼠局部创面的炎症反应程度,促进创面愈合。

综上所述,湿润烧伤膏可以加快肛瘘术后模型大鼠创面组织修复过程,机制可能与降低创面内TNF-α、IL-1β的含量,抑制炎症反应有关。本实验结果为湿润烧伤膏临床用于肛瘘术后创面治疗提供了一定理论依据,但创面的修复过程涉及的机制复杂,该药是否可通过其他靶点发挥作用有待进一步研究。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。