柴胡加龙骨牡蛎汤对2型糖尿病合并抑郁大鼠炎症因子及单胺类神经递质的影响

李浩经,吴圆圆,蔡英杰,王 彤,王 雪,李文丽,张卓辉,余真真,蔡萧君

(1. 黑龙江省中医药科学院,黑龙江 哈尔滨 150036;2. 温州市中医院,浙江 温州 325000)

流行病学调查显示,2型糖尿病与抑郁互为风险因素[1],2型糖尿病患者抑郁患病率可达24.7%[2],远高于健康人群。目前研究表明,抑郁症的发生与免疫系统的失衡密切相关,抑郁可通过影响多巴胺(DA)、五羟色胺(5-HT)等单胺类神经递质的活性导致2型糖尿病的产生[3]。2型糖尿病胰岛素抵抗与胰岛的长期轻度炎症存在一定联系,炎症反应会对2型糖尿病及抑郁症预后产生不利影响[4]。柴胡加龙骨牡蛎汤系《伤寒论》经方,既往研究证实该方剂可通过影响患者代谢水平来治疗2型糖尿病[5],同时可有效治疗情志病[6],但其作用机制尚未明确。本研究通过构建2型糖尿病合并抑郁大鼠模型,观察了柴胡加龙骨牡蛎汤对大鼠行为、血清炎症因子及海马组织单胺类神经递质五羟色胺2A受体(5-HT2aR)、多巴胺受体D2(DRD2)的影响,探讨其治疗2型糖尿病合并抑郁的机制,以为临床治疗提供依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级SD雄性大鼠50只,体重(200±20)g,8周龄,购于哈尔滨医科大学实验动物学部,动物许可证号:SCXK(黑)2019-0001,于黑龙江省中医药科学院动物实验中心适应性饲养1周。本实验方案符合公平性、安全性原则,并经黑龙江省中医药科学院动物伦理委员会批准[SYXK(黑)2-016-008]。

1.2药物 柴胡加龙骨牡蛎汤由柴胡25g、龙骨25 g、牡蛎25 g、人参10 g、桂枝15 g、茯苓15 g、清半夏10 g、黄芩10 g、大黄6 g、生姜10 g、大枣5 g组成,采用江阴天江药业生产中药免煎颗粒,根据大鼠体重计算给药量,依照说明书按比例换算备齐颗粒剂,研钵碾碎,加蒸馏水置100 ℃恒温水浴锅中加热,充分搅拌至完全溶解,定容至360 mL,生药量为0.26 g/mL,分装密封后于4 ℃冰箱保存备用。盐酸氟西汀分散片为法国礼来有限公司产品,批号:9492AA,规格:20 mg/片。

1.3试剂与仪器 血清白细胞介素-1β(IL-1β,货号:H002)、白细胞介素-2(IL-2,货号:H003)、白细胞介素-6(IL-6,货号:H007)、白细胞介素-17A(IL-17A,货号:H014-1-1)、白细胞介素-18(IL-18,货号:H015-1-1)ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所);Anti-DRD2、Anti-5-HT2aR(北京博奥森生物技术有限公司,货号:bs1008R,bs1056R);苏木素、伊红染液(南京建成生物工程研究所);免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司);DAB试剂(Thermo公司)。链脲佐菌素(STZ,北京索莱宝科技有限公司);玻璃桶(30 cm×40 cm×5 mm)、悬尾、摄像头、动物行为学分析软件(江苏赛昂斯生物科技有限公司);自制敞箱(100 cm×100 cm×40 cm);三诺血糖仪(金准型)、血糖试纸(三诺生物传感股份有限公司);M200多功能酶标仪(奥地利Tecan公司);DP72荧光显微镜(日本Olympus公司);Line Gene 9600 Real-Time PCR仪(杭州博日科技股份有限公司)。

1.4实验方法 随机取10只大鼠作为空白组,其余40只大鼠制备2型糖尿病合并抑郁模型。具体造模方法:高脂饲料连续喂养大鼠4周后禁食水24 h,以STZ 35 mg/kg溶于新鲜配制的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 4.5)中,于腹直肌与腹股沟之间注射,正常饮食72 h后禁食不禁水8 h,测定空腹血糖,从中选取空腹血糖>16.7 mmol/L的大鼠,采用慢性不可预知温和应激结合孤养模式进行抑郁造模,即采用夹尾1 min、禁水24 h、禁食24 h、束缚5 min、昼夜颠倒24 h、电击1 min、4 ℃冰水游泳5 min这7种不可预知的刺激方式,于每天不同时间采取一种的频率交替应激大鼠,使之无法预测下一次压力的类型和时间,共刺激28 d。采用数字表法,随机将造模成功的30只2型糖尿病合并抑郁大鼠分为3组各10只,空白组、模型组大鼠给予蒸馏水6.3mL/(kg·d)灌胃,氟西汀组大鼠给予盐酸氟西汀3.17 mg/(kg·d)灌胃,柴胡加龙骨牡蛎汤组大鼠给予柴胡加龙骨牡蛎汤1.638g/(kg·d)灌胃,均1次/d,连续灌胃8周。

1.5检测指标及方法

1.5.1体重和空腹血糖水平 分别在造模结束及灌胃结束并禁食8 h后测量各组大鼠体重,尾静脉采血,以血糖仪测定空腹血糖水平。

1.5.2行为学实验 分别在造模结束及灌胃结束后进行行为学实验。旷场试验(OFT):采用摄像机及行为学分析软件记录分析各大鼠在箱内的运动情况,记录5 min内活动总路程,整个过程保证环境安静,每只大鼠测试完成后均使用75%乙醇清洁设备;悬尾实验:用医用胶布将大鼠尾部距末端约1/3处缠绕固定于悬尾仪上,使大鼠呈倒挂状态,观察并记录3 min内大鼠挣扎静止情况,计算悬尾不动时间。强迫游泳实验:在强迫游泳透明玻璃桶中加温度(20±1)℃的水至30 cm处,将大鼠单独且平稳放入水中,使用摄像机及行为学分析软件记录5 min内大鼠水中表现,计算强迫游泳漂浮时间。

1.5.3血清炎症因子水平 末次灌胃结束后,腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠,腹主动脉采血,血液于常温下静置2h后,高速低温冷冻离心机(4℃,3 000 r/min)离心10 min,取上清液,严格按照相应ELISA试剂盒检测上清液中IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17A、IL-18水平。

1.5.4海马组织HE染色表现 取大鼠海马组织,进行石蜡包埋,制成石蜡切片,后脱蜡、水化,苏木精染色,自来水清洗,置于盐酸乙醇分化,并用纯水冲洗。乙醇伊红染色,纯水冲洗,再脱水,分别放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明。将切片取出,于组织上滴加中性树脂,覆盖玻片,拍照观察。

1.5.5海马组织中5-HT2aR、DRD2阳性表达情况 取大鼠海马组织,放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12 h,脱水、包埋、切片,常规脱蜡至水,PBS缓冲液冲洗,H2O2阻断内源性过氧化氢酶,枸橼酸缓冲液进行抗原修复,分别滴加5-HT2aR(1∶150)、DRD2(1∶100)一抗,4 ℃孵育过夜,PBS冲洗后分别滴加反应增强液二抗,DAB染色,封片。400倍显微镜下观察5-HT2aR、DRD2阳性表达情况。

1.5.6海马组织中5-HT2aR、DRD2 mRNA表达情况 采用Real-Time PCR法检测: 收集各组大鼠海马组织,加入TRIzol试剂以提取RNA,经M200多功能酶标仪检测浓度后,选取纯度为1.9～2.0的RNA提取液稀释至100 ng/μL。实验反应体系:1 μL组织RNA,上下游引物各1 μL,17 μL反应液(按照PCR试剂盒说明书配制)。扩增条件:95 ℃ 10 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,40个循环;溶解曲线分析:95 ℃ 10 s,台阶采样,台阶温度0.5 ℃。引物序列:5-HT2aR上游引物为5’-AGCTCTGTGCGATCTGGATT-3’,下游引物为5’-CCCCTCCTTAAAGACCTTCG-3’,长度为20 bp;DRD2上游引物为5’-CCTTGCTGTGGCTGATCTTCTGG-3’,下游引物为5’-CCTTGCTGTGGCTGATCTTCTGG-3’,长度为23 bp。采用2-ΔΔCT分析方法计算5-HT2aR、DRD2 mRNA相对表达量。

2 结 果

2.1各组大鼠体重及空腹血糖水平比较 造模结束后,各造模组大鼠体重均明显轻于空白组(P均<0.05),空腹血糖水平均明显高于空白组(P均<0.05),各造模组间大鼠体重及空腹血糖水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。灌胃结束后,空白组和氟西汀组大鼠体重均明显高于同组造模结束后及模型组(P均<0.05),柴胡加龙骨牡蛎汤组大鼠空腹血糖水平明显低于同组造模结束后及模型组(P均<0.05),氟西汀组和柴胡加龙骨牡蛎汤组大鼠体重及空腹血糖水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 空白组和2型糖尿病合并抑郁各组大鼠体重和空腹血糖水平比较

2.2各组大鼠行为学实验结果比较 造模结束后,各造模组大鼠旷场试验活动总路程均明显短于空白组(P均<0.05),悬尾不动时间、强迫游泳漂浮时间均明显长于空白组(P均<0.05),各造模组间各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。灌胃结束后,氟西汀组和柴胡加龙骨牡蛎汤组大鼠活动总路程均明显长于同组造模结束后及模型组(P均<0.05),悬尾不动时间、强迫游泳漂浮时间均明显短于同组造模结束后及模型组(P均<0.05),氟西汀组和柴胡加龙骨牡蛎汤组间各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 空白组和2型糖尿病合并抑郁各组大鼠行为学比较

2.3各组大鼠血清炎症因子水平比较 与空白组比较,模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-18水平均明显增高(P均<0.05),血清IL-2水平明显降低(P<0.05),血清IL-17A水平无明显变化(P>0.05);与模型组比较,氟西汀组大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-18水平和柴胡加龙骨牡蛎汤组大鼠血清IL-1β、IL-6水平均明显降低(P均<0.05),柴胡加龙骨牡蛎汤组大鼠血清IL-2、IL-17A水平和氟西汀组大鼠血清IL-2水平均明显升高(P均<0.05);与氟西汀组比较,柴胡加龙骨牡蛎汤组大鼠血清IL-1β水平更低(P均<0.05),血清IL-6、IL-17A水平更高(P均<0.05)。见表3。

表3 空白组和2型糖尿病合并抑郁各组大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17A和IL-18水平比较

2.4各组大鼠海马组织HE染色表现 空白组大鼠海马区组织结构、神经细胞形态均正常,细胞排列整齐,细胞质饱满,细胞核清晰;模型组大鼠神经细胞数目相对减少,体积变小,细胞核出现皱缩;与模型组比较,柴胡龙骨牡蛎汤组和氟西汀组大鼠神经细胞数目减少、体积变小、细胞核皱缩情况均有不同程度减轻,其中柴胡龙骨牡蛎汤组改善更明显。见图1。

图1 空白组和2型糖尿病合并抑郁各组大鼠海马组织HE染色表现(×400,箭头处为海马CA1区神经元)

2.5各组大鼠海马组织中5-HT2aR、DRD2阳性表达情况 模型组大鼠海马结构神经元细胞体积变小,排列紊乱,棕黄色染色颗粒少且染色浅,5-HT2aR、DRD2阳性表达平均光密度值均明显低于空白组(P均<0.05);氟西汀组及柴胡加龙骨牡蛎汤组大鼠海马结构神经元细胞体积、排列紊乱均较模型组明显改善,棕黄色染色颗粒明显增多,5-HT2aR、DRD2阳性表达平均光密度值均明显高于模型组(P均<0.05),柴胡加龙骨牡蛎汤组5-HT2aR、DRD2阳性表达平均光密度值与氟西汀组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图2及图3。

图2 空白组和2型糖尿病合并抑郁各组大鼠海马组织中5-HT2aR、DRD2阳性表达情况(免疫组化染色,×400,箭头处为海马CA1区神经元,细胞膜黄染)

图3 空白组和2型糖尿病合并抑郁各组大鼠海马组织中5-HT2aR、DRD2 阳性表达平均光密度值比较

2.6各组大鼠海马组织中5-HT2aR、DRD2 mRNA相对表达量比较 模型组大鼠海马组织中5-HT2aR、DRD2 mRNA相对表达量均明显低于空白组(P均<0.05);氟西汀组及柴胡加龙骨牡蛎汤组大鼠海马组织中5-HT2aR、DRD2 mRNA相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05),但柴胡加龙骨牡蛎汤组5-HT2aR、DRD2 mRNA相对表达量均明显低于氟西汀组(P均<0.05)。见表4。

表4 空白组和2型糖尿病合并抑郁各组大鼠海马组织中5-HT2aR、DRD2 mRNA相对表达量比较

3 讨 论

2型糖尿病属于中医“消渴病”范畴,抑郁属于中医“郁证”范畴,2型糖尿病合并抑郁属于消渴郁证范畴。柴胡加龙骨牡蛎汤方中人参、茯苓、大枣益气养血安神,柴胡、桂枝补土疏木,大黄、生姜、半夏泻热降浊,龙骨、牡蛎敛魂补虚镇逆,全方具有安神定志之功,临床用于治疗抑郁有较好疗效[7]。但中药成分复杂,作用靶点较多,为了明确柴胡加龙骨牡蛎汤治疗2型糖尿病合并抑郁的机制,本实验采用高脂饮食饲养联合STZ注射复制2型糖尿病大鼠模型,后续以慢性不可预知温和应激结合孤养模式复制2型糖尿病合并抑郁模型进行了相关研究。本实验结果显示,灌胃结束后与模型组比较,柴胡加龙骨牡蛎汤组大鼠空腹血糖水平明显降低,大鼠活动总路程明显延长,悬尾不动时间、强迫游泳漂浮时间均明显缩短,海马区神经元数量、形态均明显改善。证实柴胡加龙骨牡蛎汤可降低2型糖尿病合并抑郁大鼠血糖,保护海马区神经元,从而减轻大鼠抑郁行为。

目前研究认为,促炎信号通路的激活、单胺类神经递质分泌异常与2型糖尿病合并抑郁的发病密切相关[8]。当机体发生免疫失衡时,如IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18升高而IL-2下降可导致体内色氨酸代谢异常,使单胺类神经递质功能障碍、生成减少,从而产生抑郁症状[9]。动物实验证实,2型糖尿病大鼠血清IL-1β、IL-18、IL-6水平升高,并且与其并发症的发生存在密切联系[10-11];在慢性应激刺激后小鼠体内,促炎细胞因子IL-1β、IL-18、IL-6表达升高,同时诱发小鼠的抑郁样行为[12]。相关临床研究发现,慢性高血糖刺激使IL-1β、IL-18、IL-6过度释放,导致机体胰岛素分泌减少,损害胰岛素信号通路,加速胰岛素抵抗的发展[13];另外压力刺激导致NLRP聚集激活,IL-1β、IL-18、IL-6产生增多触发炎症反应,损伤大脑神经元,干预神经重塑,影响神经元的相互作用及认知功能,导致抑郁,而激活DRD2可导致NLRP被抑制,减少IL-1、IL-6的产生[14-15]。IL-17水平与2型糖尿病胰岛素抵抗相关,IL-17与IL-17R结合可激活核因子-κB蛋白(NF-κB)通路,上调其他炎症因子基因表达,刺激促炎细胞因子IL-1β、IL-6的产生,从而导致胰岛素抵抗[16]。然而IL-17与抑郁的相关性存有争议,有研究显示抑郁症患者血清中IL-17水平增高,且与患者抑郁情绪呈正相关[17];而Saraykar等[18]观察发现晚年抑郁患者血清IL-17A(IL-17家族代表成员)水平与抑郁症状无显著相关性,但与认知功能障碍相关。IL-2生成分泌的减少以及IL-2信号通路受阻、抑炎作用的减弱均与2型糖尿病的发生发展相关[19]。抑郁患者体内IL-2水平降低时,抑郁症状加剧,且病程进展加快[20]。本实验结果显示,柴胡加龙骨牡蛎汤组大鼠血清IL-1β、IL-6水平均明显低于模型组,血清IL-2、IL-17A水平均明显高于模型组,血清IL-18水平与模型组比较变化不明显。提示柴胡加龙骨牡蛎汤可通过调节IL-1β、IL-6、IL-2、IL-17A的表达而减轻海马神经损伤,发挥抗抑郁作用。本研究中中药上调了IL-17A的表达而没有促进IL-1β、IL-6释放,这可能是中药多靶点双重作用的结果,炎症因子具体通过何种机制、何种通路如何发挥作用最终导致出现此结果有待于后续研究。

研究表明,炎症细胞因子可通过激活存在于巨噬细胞、大脑小胶质细胞中的GTP环化水解酶1 (GCH1),使四氢生物蝶呤(BH4)向新蝶呤转化,从而导致单胺类神经递质DA、5-HT的生成减少[21]。同时GCH1的激活降低一氧化氮合酶(NOS)活性,导致机体产生自由基和氧化应激反应,BH4氧化从而使DA、5-HT合成受阻,大脑神经回路改变而产生情绪障碍[22]。Zemdegs等[23]报道,高脂肪饮食诱导的代谢紊乱会导致海马区5-HT水平降低,引发抑郁行为;而降糖药的使用可以增加抑郁大鼠5-HT的表达,从而减轻抑郁症状[24]。DRD2、5-HT2aR在中枢系统中表达极为丰富,二者所介导的信号在高级脑部功能中存在重要作用,当其发生异常时可导致精神疾病的发生。5-HT与小胶质细胞的5-HT2aR结合可调节中枢系统炎症刺激导致的趋化反应,可抑制炎症的进一步发生发展,改善抑郁[25]。DA可在胰岛β细胞合成,并由其储存和分泌,DA与胰岛β细胞表面的DRD2结合,可调节机体胰岛素分泌[26],而DRD2缺失则会抑制胰岛素释放,引发高血糖[27];另外大脑中DA浓度降低时,机体的胰岛素敏感性和β细胞功能均下降[28],这与2型糖尿病的发生密切相关。因此调节DRD2、5-HT2aR的表达水平在治疗2型糖尿病合并抑郁的过程中尤为重要。 本实验结果证明,2型糖尿病合并抑郁大鼠海马组织中5-HT2aR、DRD2 mRNA表达明显减少,柴胡加龙骨牡蛎汤组大鼠海马组织中5-HT2aR、DRD2 mRNA表达明显增加,提示柴胡加龙骨牡蛎汤可明显上调2型糖尿病合并抑郁大鼠海马组织中单胺类神经递质的表达,从而降低血糖,减轻抑郁。

综上所述, 柴胡加龙骨牡蛎汤可通过调控炎症因子及单胺类神经递质表达而明显降低2型糖尿病合并抑郁大鼠血糖,减轻海马神经炎性损伤,促进海马神经元的生成,改善大鼠抑郁行为。 然而柴胡加龙骨牡蛎汤对2型糖尿病合并抑郁大鼠炎症因子及单胺类神经递质的调控是通过哪些酶和代谢途径发挥作用的,有待结合生物分子学、网络药理学、代谢组学等研究手段进一步明确。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。