桂枝茯苓胶囊对子宫内膜炎模型大鼠NF-κB及MAPK信号通路的影响*

孙兰，李家春，皇立卫，闫宇辉，王振中，王丽

（1.江苏食品药品职业技术学院 淮安 223003；2.江苏财经职业技术学院 淮安 223003；3.中药制药过程新技术国家重点实验室 连云港 222001）

传统医学将子宫内膜炎归属为“不孕”、“痛经”等范畴[9]，桂枝茯苓胶囊是源于经典处方的现代中药制剂，处方由桂枝、茯苓等五味中药组成，具有活血化瘀、缓消癥块之功效，临床上主要用于盆腔炎性疾病、原发性痛经和子宫肌瘤等疾病，疗效显著[10]。研究表明桂枝茯苓胶囊能够有效降低盆腔炎患者血清中白细胞介素10（Interleukin10，IL-10）、白细胞介素4（Interleukin4，IL-4）等细胞炎症因子的水平[11]。本实验采用LPS诱导子宫内膜炎模型大鼠，考察桂枝茯苓胶囊对NF-κB和MAPK信号通路中关键信号传导蛋白的影响，为临床用药提供理论依据。

1 材料

1.1 动物

SD大鼠60只，雌性，体质量200±20 g，SPF级，购自扬州大学比较医学中心，合格证号：SCXK（苏）2017-0007。大鼠饲养于江苏康缘药业股份有限公司SPF级实验场所，室温（24±2）℃，相对湿度40%-60%，饲养环境通风良好，自由饮水，标准鼠饲料饲养，每日保持12 h光照。

1.2 药物与试剂

桂枝茯苓胶囊（200506，0.31 g/粒，江苏康缘药业股份有限公司）；脂多糖（Sigma公司）；髓过氧化物酶（MPO）测试盒（南京建成生物工程研究所）；醋酸地塞米松片（辰欣药业股份有限公司）；IL-1β试剂盒（eBioscience公司）；IL-6试剂盒（eBioscience公司）；TNF-α试剂盒（eBioscience公司）；p38、p38（phospho T180+Y182）、NF-κBp65，NF-κB p65（phospho S276）、IκBα抗体（Abaca公司）；IκBα（phospho S36）抗体（Abaca公司）；ERK抗体（CST公司）； HRP标记的羊抗兔的二抗（CST公司）；Precision plus ProteinTM Dual color Standards（Bio-Rad公司）。

1.3 仪器

ChemiDoc XRS型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；BS224S型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；涡旋混匀仪（杭州瑞诚仪器有限公司）；Flexstation®3钙流工作站（美国Molecular Devices公司）；蛋白质小型垂直电泳槽（美国Bio-Rad公司）；UV-1800紫外-可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；CENTRFUGE5840型冷冻离心机（Eppendorf）；数显恒温水浴锅（山东鑫煤矿山设备集团有限公司）；匀浆机（德国IKA）；1703930转膜仪（美国Bio-Rad公司）；BX41显微镜（OLYMPUS公司）；YM30立式压力蒸汽灭菌器（上海新诺）。

2 方法

2.1 分组、给药及模型复制

选取健康60只雌性大鼠，按照体重随机分为6组，即假手术组、模型组、阳性组（醋酸地塞米松，2.5 mg·kg-1）、桂枝茯苓胶囊高、中、低剂量组（0.54、0.27、0.14 g·kg-1，各相当于按体表面积折算的人临床日用剂量的2、1、0.5倍），每组10只。各给药组连续灌胃给药7天，假手术组、模型组灌胃给与0.5% CMCNa，每天灌胃1次，灌胃体积10 mL·kg-1。末次给药1 h，参照文献方法复制大鼠子宫内膜炎模型[12]，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉各组动物，假手术组大鼠仅做开腹和关腹操作，其余组大鼠左侧子宫用注射器刮伤子宫内膜并注射（1.0 µg·µL-1）LPS生理盐水溶液0.25 mL，模型复制24 h后处死动物。

2.2 子宫组织处理

注射LPS 24 h后，采用脱颈椎方式处死各组动物，采用75%乙醇消毒腹部，打开各鼠腹腔取左侧子宫，冰上取一部分左侧子宫组织，放入10%甲醛溶液中固定待测病理，剩余子宫组织-80℃冰箱中保存备用。

2.3 HE染色观察子宫病理变化

将子宫组织从固定溶液中取出，贴好标签放于脱水盒内依次脱水处理，随后用石蜡包埋子宫组织，包埋好的组织切片为4 µm厚度。组织切片用苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin staining，HE）染色处理。在光镜下观察子宫腔、固有层腺体、子宫内膜有无炎细胞浸润及充血水肿等病理变化。观察指标如下：①观察子宫腔有无缩小、粘连等变化，无病变记0分；轻度病变及病变范围小于1/3记1分；中度病变、病变范围在1/3-2/3之间记2分；重度病变、病变范围在2/3以上的记3分。②观察子宫内膜及固有层腺体上皮细胞有无变性坏死，无病变记0分；轻度病变及病变范围小于1/3记1分；中度病变、病变范围在1/3-2/3之间记2分；重度病变、病变范围在2/3以上的记3分。③观察子宫粘膜固有层有无炎细胞浸润，有无充血水肿，按照无明显、轻度、中度、重度不同病变程度分别记0分、1分、2分、3分。④观察子宫肌层有无炎细胞浸润，按照无明显、轻度、中度、重度不同病变程度分别记0分、1分、2分、3分。累加每组各指标所有分数。

2.4 比色法检测MPO活性

称取子宫组织，按照1:19加匀浆介质制备成5%的组织匀浆，根据说明书方法操作，在460 nm波长处测定各管吸光度值，根据公式计算各组MPO活性。

2.5 ELISA检测子宫组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平

从-80℃冰箱中取出子宫组织，解冻后称取适量放入离心管中，按照子宫组织与生理盐水1∶9的比例，用移液管加入生理盐水于各个离心管中，用自动匀浆机研磨，离心机设置温度设置4°C，转速设置3000 r·min-1，离心管放入离心机中离心15 min，离心结束取上清液用于因子检测，根据说明书操作步骤依次检测IL-6、IL-1β、TNF-α炎性因子水平。

LU Wen-juan, CHEN Jing, ZHANG Jing-qing, JIANG Xin-hui

2.6 Western blot法检测子宫组织中NF-κB p65、IκBα、ERK、p38及其磷酸化蛋白表达水平

称取各组子宫组织，用匀浆机研磨成浆，加入适量的含苯甲基磺酰氟的强效裂解液，分别提取各组大鼠子宫组织蛋白，并采用蛋白质定量（Bicinchoninic acid，BCA）法进行蛋白定量，各组取相同质量的蛋白进行电泳，电泳结束后将蛋白质转至聚偏氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，封闭2 h。用洗膜液（Tris Buffered Saline Tween，TBST）洗涤三次后加入一抗，4℃冰箱放置孵育过夜。TBST洗膜3次后加入稀释二抗，放置摇床上，室温轻摇孵育2 h，TBST漂洗膜3次。采用化学发光法（Enhanced Chemiluminescence，ECL）显影并进行分析。

2.7 数据处理

检测数据用GraphPad Prism5.0分析统计，结果用均值±标准差（±s）表示，对多个样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，P＜0.05具有统计学意义。

3 结果

3.1 对子宫组织病理的影响

如图1所示，组织学观察显示假手术组子宫组织结构完整，模型组子宫表现出明显的病理变化，如子宫内膜充血水肿、大量炎症细胞浸润，部分结构消失，桂枝茯苓胶囊能明显改善LPS诱导的子宫组织损伤。如表1所示，与假手术组比较，模型组大鼠子宫组织病理评分显著升高（P＜0.01），表现在子宫腺体上皮细胞有变性、坏死，子宫内膜层有以中性粒细胞为主的炎细胞浸润；与模型组大鼠子宫病变相比较，阳性组（醋酸地塞米松）、桂枝茯苓胶囊3个剂量组大鼠子宫组织病变明显减轻，病理评分显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。这些结果表明桂枝茯苓胶囊可以减轻LPS诱导的子宫病理组织损伤。

表1 对子宫组织病理的影响（±s，n=10）

表1 对子宫组织病理的影响（±s，n=10）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别假手术组模型组地塞米松组桂枝茯苓胶囊组桂枝茯苓胶囊组桂枝茯苓胶囊组剂量--2.5 mg·kg-1 0.54 g·kg-1 0.27 g·kg-1 0.14 g·kg-1病理评分1.23±0.19 6.86±1.89##3.27±1.13**4.07±1.26**4.52±1.27**4.67±1.39*

图1 对子宫组织病理的影响（HE，×200）

3.2 对MPO活力的影响

各组大鼠子宫组织MPO活力数据如表2所示。与假手术组对比，模型组的MPO水平明显升高（P＜0.01）；与模型组对比，地塞米松组和桂枝茯苓胶囊组（0.54 g·kg-1）的MPO水平均显著下降（P＜0.01），桂枝茯苓胶囊组（0.27、0.14 g·kg-1）的MPO水平均显著下降（P＜0.05）。结果 提示桂枝茯苓胶囊可抑制LPS诱导的子宫内膜炎小鼠炎症细胞过度浸润。

表2 对MPO活力的影响（±s，n=10）

表2 对MPO活力的影响（±s，n=10）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别假手术组模型组地塞米松组桂枝茯苓胶囊组桂枝茯苓胶囊组桂枝茯苓胶囊组剂量--2.5 mg·kg-1 0.54 g·kg-1 0.27 g·kg-1 0.14 g·kg-1 MPO活力（U·g-1）0.25±0.02 0.78±0.05##0.38±0.04**0.42±0.03**0.48±0.04*0.52±0.05*

3.3 对子宫组织IL-1β、IL-6、TNF-α细胞因子的影响

各组IL-1β、IL-6、TNF-α细胞因子水平表3所示。与假手术组大鼠子宫组织因子相比较，模型组大鼠子宫组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高（P＜0.01）；与模型组大鼠子宫组织因子相比较，地塞米松组IL-1β、IL-6、TNF-α水平均降低（P＜0.01），并且桂枝茯苓胶囊3个剂量组子宫组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平较模型组下调（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 对子宫组织IL-1β、IL-6、TNF-α细胞因子的影响（±s，n=10）

表3 对子宫组织IL-1β、IL-6、TNF-α细胞因子的影响（±s，n=10）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别假手术组模型组地塞米松组桂枝茯苓胶囊组桂枝茯苓胶囊组桂枝茯苓胶囊组剂量--2.5 mg·kg-1 0.54 g·kg-1 0.27 g·kg-1 0.14 g·kg-1 IL-1β（pg·mL-1）51.42±6.17 161.26±20.29##83.22±8.68**98.32±10.59**104.25±12.62**110.71±12.86**IL-6（pg·mL-1）153.23±22.28 382.56±36.25##232.67±22.58**266.45±21.68**272.41±23.81**342.62±28.92*TNF-α（pg·mL-1）97.26±20.22 252.98±32.52##142.61±30.59**167.91±29.15**183.76±28.52**211.63±32.38*

3.4 对子宫组织中NF-κB p65、IκBα、ERK、p38蛋白表达水平的影响

采用Western blot法检测假手术组、模型组、地塞米松组、桂枝茯苓胶囊3个剂量组子宫组织中NF-κB p65、IκBα、ERK、p38及其磷酸化蛋白的表达水平，结果如图2、3所示：与假手术组比较，模型组NF-κB p65、IκBα、ERK、p38蛋白磷酸化水平显著升（P＜0.01）；与模型组比较，桂枝茯苓胶囊各剂量组NF-κBp65、IκBα、ERK、p38蛋白磷酸化水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。以上结果说明，桂枝茯苓胶囊能抑制子宫内膜炎大鼠的子宫组织中NF-κB p65、IκBα、ERK、p38的蛋白表达。

图2 对NF-κBp65、IκBα及其磷酸化蛋白水平的影响（±s，n=3）

图3 对ERK、p38及其磷酸化蛋白水平的影响（±s，n=3）

4 讨论

子宫内膜炎常由细菌、病毒、真菌、支原体和其他感染引起[13]，该病如治疗不彻底，常会引起慢性盆腔痛、输卵管妊娠等并发症，给患者的身心健康带来严重危害[14]。中医认为血瘀是子宫内膜炎主要病机，归为“不孕”、“妇人腹痛”等范畴[15]。研究表明，约10%左右的女性不孕是由盆腔炎性疾病引起[16-17]。LPS是细菌细胞壁的成分之一，能诱导炎性细胞因子生成、组织水肿和损伤[18]。本研究采用宫腔注射LPS复制大鼠子宫内膜炎模型，HE染色观察到模型组大鼠子宫腺体上皮细胞排列紊乱、充血，子宫内膜炎性细胞浸润。桂枝茯苓胶囊组大鼠子宫组织结构完整，只有轻微的子宫内膜病变和少量的炎性细胞浸润。结果 提示，桂枝茯苓胶囊对LPS引起的大鼠子宫内膜炎具有抗炎作用。髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）作为组织中性粒细胞活性状态的直接指标[19]。研究表明MPO通过损伤宿主组织与多种炎症性疾病相关[20]。本研究通过检测MPO活性来评价桂枝茯苓胶囊对LPS诱导的子宫内膜炎大鼠的保护作用。结果 显示，桂枝茯苓胶囊组MPO活性显著降低，结果表明，桂枝茯苓胶囊对LPS诱导的MPO活性有明显的抑制作用。

炎症在子宫内膜炎的发展过程中起着至关重要的作用。LPS可诱导炎性细胞因子的释放[21]。这些炎性细胞因子可导致子宫损伤子宫组织。因此，抑制炎性细胞因子的产生可能是治疗子宫内膜炎的靶点。炎症是宿主对细胞和组织功能障碍的基本防御反应，主要表现为TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性细胞因子产生的增加[22]。在炎症反应过程中，TNF-α由调节基因诱导产生，是炎症反应的始动因子，能够促进IL-1β、IL-6细胞因子、趋化因子和细胞粘附分子的释放和表达[23]。在体内，TNF-α能激活细胞内NF-κB信号通路，从而促进促炎细胞因子的产生[24]。促炎细胞因子IL-1β是中枢神经系统急性炎症过程的关键调节器[25]，研究表明过量的IL-1β炎症细胞因子产在子宫内膜炎的发展中发挥关键作用，因为它在免疫反应中充当“主”细胞因子[26]。IL-1β是一种重要的炎症细胞因子，其产生和分泌基于NF-κB的激活，在调节下游炎症反应中发挥重要作用，参与多种炎症性疾病过程[27]。IL-6是一种多效性细胞因子，调节多种生物学过程，包括炎症、免疫反应和急性期反应的发展[28]。为了进一步研究桂枝茯苓胶囊对LPS诱导大鼠子宫内膜炎的治疗作用，子宫组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平被检测。研究结果表明，桂枝茯苓胶囊能够显著抑制子宫组织的TNF-α、IL-1β、IL-6炎症细胞因子水平。

为了进一步研究桂枝茯苓胶囊如何减轻LPS诱导的炎症反应，本实验通过Western blot检测NF-κB信号通路活性。NF-κB信号通路是一种重要的炎症关联途径，它们可以通过介导下游信号网络来调节炎症的发展[29]。NF-κB信号通路参与调节介导炎症的基因以及各种细胞因子，而且与许多炎症疾病密切相关[30]。正常情况下，NF-κB定位于细胞质上，并与其抑制剂IκB结合。当受到各种诱导剂的刺激时，IκB被降解，NF-κB p65磷酸化后转位到细胞核中，导致TNF-α、IL-1β、IL-6等靶基因的转录，进而引发炎症反应[31]。本研究Western blot分析结果显示模型组大鼠IκBα、NF-κBp65磷酸化蛋白表达升高，表明NF-κB通路过度激活。桂枝茯苓胶囊组大鼠p-NF-κB p65及p-IκBα表达较模型组明显降低，表明桂枝茯苓胶囊可明显抑制NF-κB通路活性。结果 提示，桂枝茯苓胶囊通过调控LPS诱导的大鼠子宫内膜炎NF-κB信号通路蛋白的表达，对大鼠炎症反应具有保护作用。

MAPK是信号转导途径的另一个关键调节因子，能够调节炎症介质的水平[32]。MAPKs是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，包括ERK、JNK和p38。MAPKs可以通过外部信号和激活诱导下游炎症基因的转录，该通路的激活可促进炎症细胞因子的生成而加剧炎症反应[33-34]。本研究发现子宫腔注射LPS模型组大鼠p38和ERK的磷酸化水平增加，桂枝茯苓胶囊显著抑制p38和ERK蛋白的磷酸化。研究结果提示桂枝茯苓胶囊可能通过抑制MAPK信号通路发挥抗炎作用。

综上所述，研究结果表明桂枝茯苓胶囊通过阻断NF-κB和MAPK信号传导，抑制促炎细胞因子的分泌，从而减轻子宫内膜损伤。本实验结果进一步验证了桂枝茯苓胶囊多靶点、多途径防治妇科疾病作用特性。但桂枝茯苓胶囊成分复杂，而且细胞内信号通路相互间存在交叉作用，因此后续将进一步研究桂枝茯苓胶囊防治盆腔炎的活性成分以及对上述炎性细胞信号通路网络交汇的作用。