2型糖尿病阴虚证小鼠模型生物节律变化及六味地黄汤对其影响*

任威铭，战丽彬，崔荣兴，孙晓霞，翁泽斌

（1.南京中医药大学中医学院·中西医结合学院 南京 210023；2.辽宁中医药大学 中医药创新工程技术中心 沈阳 110847）

糖尿病是全球高发慢性代谢性疾病，据统计我国2020年糖尿病患病率的统计约为11.2%，2型糖尿病（Type 2 diabetes，T2DM）占90%以上[1]，因其逐渐累及全身多个组织器官，需要终身治疗，给个人、家庭和社会带来沉重负担。

2型糖尿病患者多出现“多食、多饮、多尿、消瘦”的三多一少临床症状，故中医多将其归于“消渴病”范畴，阴虚证是其主要基本证。2021年《2型糖尿病病证结合诊疗指南》将2型糖尿病中期统一辨为“气阴两虚证”，晚期分肝阴虚证、阴阳两虚证，多种证型与阴虚密切相关[2]。2型糖尿病阴虚证临床表现多见有舌红少苔、五心烦热、盗汗、午后潮热、脉细数等症状。阴虚潮热的发作时间呈午后或夜半加重趋势，清·汪必昌《医阶辨证·阴分潮热三证辨》中提及“阴虚潮热，午后潮夜半止，其热下体甚”[3]。这种体温改变随时间而紊乱的表现提示了阴虚证症状的产生可能与机体生物节律紊乱有关。

生物节律指生物在生理、行为等方面反复出现的周期性特征。生物钟是生物适应外界环境规律性变化的一种内在机制，其调节中枢位于下丘脑的视交叉上核SCN区域[4]，通过神经-内分泌系统调节外周组织，使机体各组织时钟趋于一致。人体的节律周期约为24 h，其核心反馈环路由芳烃受体和转运蛋白类似蛋白1（Brain and muscle arnt-like protein-1，Bmal1）、时钟基因（Circadian locomotor output cycles kaput，Clock）、周期蛋白（Period circadian clock，Per）、隐花色素（Cryptochrome，Cry）所组成，调控大部分生命活动过程[5]。研究表明，2型糖尿病的发生发展与生物节律紊乱密切相关[6]，主要表现在血糖、血压、激素分泌等多种方面，同时机体体温昼夜节律紊乱，基础体温升高，昼夜体温差值减小[7]。这种糖尿病的生物节律紊乱和阴虚证潮热体温变化异常是否有关还需进一步探讨。为此，我们通过建立2型糖尿病阴虚证模型，动态监测模型体温变化，结合分子生物学实验，以探讨生物节律在2型糖尿病阴虚证“潮热”症状的变化情况及分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

在本研究中，动物实验按照美国实验动物资源研究所颁布的《实验动物护理和使用指南》（Guide for the Care and Use of laboratory Animals）原则进行，并经南京中医药大学动物伦理委员会批准（批准号201910A033）。采用南京君科生物工程有限公司提供的SPF级别8周龄雄性db/db小鼠99只，体质量为40-50 g及其同窝野生对照型小鼠21只，饲养于南京中医药大学特定的无病原体动物实验中心，恒温（24±2℃）、恒湿（65%±5%）、12 h明/暗循环（7：00-19：00）。动物喂食60Co辐照实验动物维持饲料。可以自由取用食物和高压灭菌水。

1.2 实验药物

伤阴药和六味地黄汤所用饮片均购自南通三越中药饮片有限公司（中国南通）。伤阴药组成为黑顺片（批号：190425）、肉桂（批号：190509）、制吴茱萸（批号：190514），黑顺片、肉桂、制吴茱萸按照1:1:1的比例配制。药材提前浸泡30 min，将黑顺片先煎煮沸30 min。加入浸泡过的肉桂与制吴茱萸的混合液，混合后大火煮沸，转小火再煎煮1 h，倒出药液。水煎2次，混合后浓缩得到伤阴药浓度1 g·mL-1，4℃保存。

六味地黄汤选用熟地黄（批号：190817）、酒萸肉（批号：190829）、山药（批号：190109）、泽泻（批号：190718）、牡丹皮（批号：190723）、茯苓（批号：190217），根据中国药典（中国药典委员会，2015）的方法制备。药材浸入8倍冷水中30 min后大火煮沸转小火煎煮30 min。水煎2次。混合后浓缩最终生药含量为5.63 g·kg-1为低剂量，11.26 g·kg-1为中剂量，22.52 g·kg-1为高剂量，4℃保存。

1.3 主要试剂和仪器

Bmal1抗体（Santa cruz，sc-365645）；Clock（Santa cruz，sc-271603）；Per1（ABclonal，A8449）；Per2（ABclonal，A5107）；Per3（Abcam，Ab177482）；Cry1（ABclonal，A6890）；Cry2（Proteintech，13997-1-AP）；β-Actin（CST，3700S）；羊抗小鼠IgG（Boster，BA1050）；羊抗兔IgG（Boster，BA1054）。红外测温仪（CEM，中国，DT-8838）；呼吸麻醉仪（Gene&I，中国，AMS）；动物手术冷光源（AS ONE，日本，GR-60W）；电子调温电热套（泰斯特，中国，98-1-B）；旋转蒸发仪（Eyela，日本，N3010）；超纯水系统（Milli-Q，美国Integral S）；磁力搅拌仪（IKA，德国RCT Digital）；小型台式高速离心机（Thermo，美国Heraeus Fresco-21）；十二通道组织均质仪（QIAGEN，美国Tissuelyser LT）；垂直电泳槽（Bio-Rad，美国PowerPac Basic）；超微量分光光度计（ThermoFisher，美国ND-ONE-W）；超灵敏多功能成像仪（GE，美国AI600）。

1.4 分组及造模方法

适应性喂养3天后，测量体质量和空腹血糖，选取空腹血糖≥16.7 mmol·L-1的2型糖尿病小鼠。将同窝野生对照小鼠分为正常对照组（C组）9只、阴虚证组（Y组）12只；2型糖尿病小鼠分为2型糖尿病组（D组）12只、2型糖尿病阴虚证组（DY组）11只、糖尿病六味地黄汤低剂量组（DL组）12只、糖尿病六味地黄汤中剂量组（DM组）12只、糖尿病六味地黄汤高剂量组（DH组）12只、糖尿病阴虚证六味地黄汤低剂量组（DYL组）14只、糖尿病阴虚证六味地黄汤中剂量组（DYM组）13只、糖尿病阴虚证六味地黄汤高剂量组（DYH组）13只。

采用“热盛伤阴”的造模方法，予阴虚证造模组别（Y组、DY组、DYL组、DYM组、DYH组）每天予小鼠0.1 mL·10 g-1的伤阴药药液体积灌胃；正常对照组（C组）、2型糖尿病小鼠（D组、DL组、DM组、DH组）每只小鼠每天予以同体积超纯水灌胃，造模时间连续8周。根据前期实验结果，阴虚证造模于第4周完成，造模成功后小鼠表现为口干（饮水量增加、唾液流率增加）、大便干燥（粪便含水量减低）、皮肤干燥（皮肤含水量减低）、虚性亢奋（活动度与易激惹程度增加）等表现。糖尿病小鼠选用db/db自发性糖尿病小鼠，随着年龄增长，会逐渐自发表现出2型糖尿病特征。从第4周开始，六味地黄汤给药组（DYL组、DYM组、DYH组、DL组、DM组、DH组）于每天16：00予以每只小鼠0.1 mL·10 g-1的药液体积予以灌胃，正常对照组和2型糖尿病组每只小鼠同时予以相同体积超纯水灌胃，给药时间连续4周。

1.5 标本采集

晚上禁食12 h后，用异氟烷麻醉小鼠后安乐死，迅速收集下丘脑、肝脏组织，在液氮快速冷冻，以备后续分析。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 体温检测

使用非接触红外测温仪检测小鼠肛温、心前区温度、四肢爪心温度。将仪器测温探头对准检测部位正中，距离1-2 cm，每周1次，测量时间分别为8：30、15：00、20：00。以评价小鼠体温节律。

1.6.2 小鼠下丘脑和肝脏生物节律蛋白表达水平检测

采用Western blot技术检测。提取小鼠下丘脑和肝脏组织总蛋白，使用超微量分光光度计测定蛋白浓度。电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，按照1：1000加入一抗，4℃孵育过夜。次日TBST充分洗膜，加入二抗（1:2000），TBST充分洗膜，ECL发光显影后分析。

1.7 统计学方法

使用Graphpad 8.0统计软件进行数据处理，计量资料以（均数±标准误）表示。统计学分析方法为单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠体温波动情况

从第5周开始，C组肛温出现规律性的8：30降低、15：00升高、20：00降低的波动趋势；Y组肛温普遍高于其余各组；D组则节律紊乱，肛温趋于平稳，有规律的温度波动消失；DY组肛温高于D组，并表现出了不同于C组的节律波动，虽然显示出午后升高的趋势，但波动趋势较正常组平稳；给予六味地黄汤干预后，2型糖尿病模型未表现有明显规律性体温波动变化；而DYH组显示出对肛温节律的恢复作用，从第5周开始给药后，高剂量组显示出“低、高、低”的规律波动，这种波动幅度大于DY组的波动幅度，可能是2型糖尿病小鼠正常节律恢复的表现（图1A）。心前区温度未见节律波动（图1B）。双上肢温度可见，C组在各实验周均出现规律性的8：30降低、15：00升高、20：00降低的较明显的波动；Y组昼夜体温变化幅度较大，但未显规律性波动；D组则节律紊乱，有规律的温度波动消失；DY组可见自第6周开始，上肢温度出现规律的节律波动，显示出8：30和20：00较低，15：00升高的趋势；给予六味地黄汤后，DYH组结果也显示出上肢温度8：30降低、15：00升高、20：00降低的节律变化规律（图1C）。双下肢温度可见，C组第1、3、4周外，其他实验周均出现规律性的8：30降低、15：00升高、20：00降低的波动规律；D组则节律紊乱，有规律的温度波动消失；六味地黄汤干预后，DYH组表现出与上肢相似的变化规律（图1D）。六味地黄汤干预后，以方测证，高剂量组能够进一步恢复肛温、双上肢爪心温度和双下肢爪心温度节律，因此在后续分子实验中，选择高剂量组为最佳剂量进行分子表达的验证（图1）。

图1 各组小鼠不同部位温度节律变化

通过对各组体温波动变化的分析发现，C组、Y组、DY组及六味地黄汤干预后体温都存在一定的节律性表现，为了进一步区别节律变化的差异，对实验第8周的各部位体温进行分析，结果发现，8：30时，Y小鼠肛温低于C组（P＜0.001），但在15：00时，Y证平均肛温最高（P＜0.001），至20：00，Y组体温下降，可见Y组的体温波动明显大于C组波动，下午的体温升高于个体而言更加明显，虽然仍在正常体温范围内，但会导致自觉发热的情况出现。D组肛温始终明显低于正常小鼠的肛温（P＜0.01），DY组呈现出比D组升高的趋势，六味地黄汤干预后，DYH组相对平稳，低-高-低的变化趋势存在，但尚无统计学差异（图2A）。各组小鼠心前区温度在8：00时未表现明显差异；至15：00时，Y组、D组、DY证组较正常组心前区温度升高（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01），20：00时，DYH组较DY组心前区温度明显下降（P＜0.05，图2B）。各组小鼠四肢爪心温度变化可见，Y组始终高于C组，但在晨间和晚间尚无统计学差异，午后则差异明显（P＜0.001，图2C-2D）；DY组较D组变化趋势相似（图2C-2D）；相较于D组，六味地黄汤的干预没有规律的变化趋势，但是DYH较DY组则在15:00体现出了明显的回调（P＜0.01，图2C-2D）。说明六味地黄汤在调节2型糖尿病阴虚证的体温节律紊乱中效果更明显，而对2型糖尿病非阴虚证疗效不明，以方测证，进一步说明了阴虚证状态下体温变化存在异常。

图2 各组小鼠第8周体温波动情况

综上可见，正常小鼠存在体温规律性波动，但幅度相对稳定，阴虚证状态下，15：00时，体温会出现显著上升，这可能是阴虚证个体自觉午后发热的原因。2型糖尿病的个体基础体温较正常个体偏低，而2型糖尿病阴虚证状态下会表现出上升趋势。六味地黄汤是治疗2型糖尿病阴虚证的经典方剂，在经过其干预后，非阴虚证组体温波动未体现出明显规律，但阴虚证组回调明显，体温波动趋势以及四肢爪心发热的变化趋势与正常组更相似，相对于阴虚证组大幅度的体温波动有好转表现。

2.2 下丘脑生物节律蛋白表达情况

下丘脑中，D组Clock蛋白表达较C组显著性降低（P＜0.05），DY组Bmal1和Clock较D组表达具有升高趋势。在给药组中，DH组Clock较2型糖尿病组显著性升高（P＜0.05）。周期蛋白Per2在D组中较C组表达显著性降低（P＜0.001），而在D组中显著性升高（P＜0.0001）；给予六味地黄汤后，DH组较D组表达有上升趋势，DYH组给药后表达显著下降（P＜0.01）。而Per1和Per3在所有组中未见明显改变。Cry是由Bmal1和Clock结合后促使Cry mRNA转录，在胞外翻译为蛋白，再进入核内抑制Bmal1和Clock的合成，同时也能通过蛋白酶体降解以保持周期性。在本研究中，D组和DY组的Cry2表达较C组均显著降低（P＜0.05），DH组的Cry1和Cry2较D组表达均显著升高（P＜0.05）（图3）。

图3 下丘脑生物钟蛋白变化（n=3）

2.3 肝脏生物钟蛋白表达情况

在肝脏中，D组Bmal1和Clock较正常对照组下降，而DY组较D组表达增加，表明2型糖尿病存在生物节律蛋白表达下降，而伤阴药可能通过过表达Bmal1和Clock影响生物钟分子机制（图4）。D组Per3蛋白表达较C显著性降低（P＜0.05），DY组较D组显著性升高（P＜0.001），表明在该模型中，伤阴药可能通过上调Bmal1和Clock的蛋白表达，促进Per3的表达增加，与下丘脑不同。Per1和Per2在各组间无显著性差异。D小鼠的Cry1表达较C组显著性降低（P＜0.05），DY组较D组的Cry1表达显著性升高（P＜0.05）。Cry2表达在各组间无显著性差异。

图4 肝脏生物钟蛋白变化（n=3）

3 讨论

2型糖尿病中医多属消渴病范畴，具有五脏脆，素体脏腑阴虚的病理基础。清·丹波元坚《杂病广要·消渴》提出“消渴属阴虚，津液不足”[8]。中医证候研究显示阴虚证是2型糖尿病重要证型之一，潮热是其常见临床表现。清·丹波元坚《杂病广要·寒热门》认为“潮热有作有止，若潮水之来，不失其时，一日一发”[8]。2型糖尿病肝肾阴虚，午后阴气当旺不旺，阳气不能潜藏于内而外越，表现为午后潮热，至日暮而止。六味地黄丸出自宋代儿科大家钱乙《小儿药证直诀·卷下》，张介宾于《景岳全书》改为汤剂，由熟地、山茱萸、山药、泽泻、茯苓、丹皮组成。全方补泻兼施，补养肝、脾、肾之阴，泻肾浊虚火，主治肾阴亏损、腰膝酸软、消渴、骨蒸潮热等症，为治疗肾阴亏虚经典方剂。现代医学表明六味地黄汤能够通过影响血管生成及内皮功能、改善炎症反应及缺氧反应发挥治疗2型糖尿病的作用[9]。

本研究采用自发性糖尿病小鼠模型结合“热盛伤阴法”造模，选用自发性2型糖尿病模型db/db小鼠[10]，具有高血糖、高胰岛素血症、肥胖等2型糖尿病特点。“热盛伤阴”造模方法选用辛热之品附子、肉桂、吴茱萸灌服4周，取中医过食辛温燥热，脾胃运化失职，积热内蕴，化燥伤津，久则耗伤阴液发为阴虚之意。课题组前期运用该方法已成功建立阴虚证动物模型[11]。

体温节律由下丘脑中的视交叉上核（SCN）协调能量摄入与血管舒缩所等生理活动调控，涉及中央起搏器和外周组织细胞内的复杂分子钟网络，多使用非接触式红外温度计对直肠、阴道、口腔或耳廓等部位多次测量，以准确评估体温昼夜变化[12]。本实验通过监测小鼠四肢爪心温度、心前区温度及肛温改变，全面反映2型糖尿病阴虚证小鼠模型体温变化。研究发现，2型糖尿病组的各部位体温波动节律紊乱，2型糖尿病阴虚证动物模型肛温、双上肢表现出了较为明显8：30降低、15：00升高、20：00降低的体温波动节律。此现象在第4周成模后表现更为明显，长时程给予温燥伤阴之品，耗伤小鼠阴液，阴虚阳亢，于15：00检测时体温升高。既往研究表明，给予附子、肉桂等热性药物使小鼠TNF-α节律改变，出现发热症状[13]。同时，“阴虚内热”可引起机体生物节律紊乱，能量代谢失常[14]。而给予高剂量六味地黄汤后体温波动节律幅度降低，具有改善作用，证明了2型糖尿病阴虚证体温节律的昼夜波动趋势。现代研究表明，六味地黄汤中丹皮、山茱萸、泽泻等药物也都具有抗炎、解热功效，为该方降低体温，恢复正常体温节律提供科学依据[15-17]，猜测这种作用也有可能通过调节生物钟分子机制所实现。

分子实验结果显示2型糖尿病阴虚证模型生物钟基因在下丘脑和肝脏中均发生改变，表明这种“潮热”样体温节律改变可能是由于生物钟核心反馈环路蛋白异常而引起。生物钟核心反馈环路包括正调控元件和负调控元件。Bmal1与Clock结合为异源二聚体（Bmal1-Clock），激活靶基因启动子E-box驱动Pers和Crys转录表达，Per和Cry蛋白在细胞质中形成异二聚体，转位到细胞核，通过与复合物Bmal1-Clock的相互作用抑制自身转录[18]。

在本实验中，2型糖尿病模型下丘脑节律基因表达较为稳定，Clock、Per2和Cry2表达下降，而给予伤阴药造模后，Per2表达显著性升高，表明伤阴药能增加下丘脑Per2蛋白表达，这可能是2型糖尿病阴虚证模型体温节律变化引起“潮热”症状的重要机制。下丘脑SCN区域是生物节律的调节中枢，具有调节体温的功能，其节律相位在一定温度范围内稳定，这种温度补偿机制是不同区域相互联系、协同调控的结果，而非细胞水平自主性[19]。SCN区域不易受环境温度变化影响，可在一定温度变化范围内保持稳定的鲁棒性，通过调节体温使外周组织节律相位一致。研究表明，Per2可影响体温节律，当将per2启动子区域中的Ebox顺式元件突变后，可持续的分子时钟振荡消除，同时昼夜运动活动和体温节律变得不稳定[20]。也有报道表明，给予新生小鼠辣椒素皮肤涂抹刺激后，昼夜体温升高，Per2蛋白表达升高，表明了Per2对温度具有敏感性[21]。在阴虚证中，外界环境温度未有变化，但机体阴液亏耗，阳热偏盛，于午后发热，这种发热常稳定存在，可能原因是由于下丘脑SCN区域生物节律蛋白Per2表达持续升高所致，从而形成稳定的午后发热。

肝脏作为生物节律外周组织，受外界环境温度、饮食等多种因素影响，也受到下丘脑SCN区域的调控。实验结果表明，2型糖尿病组的肝脏生物钟蛋白表达较正常对照组降低，表现在Clock、Per3、Cry1上。2型糖尿病阴虚证模型上发现可Bmal1、Clock、Per1、Per3、Cry1蛋白表达增加，说明2型糖尿病阴虚证小鼠出现节律改变，而六味地黄汤可能缓解这种节律改变。在2型糖尿病模型中，由于Bmal1和Clock基因表达下降，其下游生物钟基因Per1、Per2、Per3和Cry1也呈下降趋势。比较正常对照组与阴虚证组，2型糖尿病和2型糖尿病阴虚证组，可以发现，阴虚证组节律基因表达升高幅度较小，而糖尿病阴虚证的蛋白表达较糖尿病明显升高。表明2型糖尿病受伤阴药造模影响后，更容易发生节律改变，而正常对照组受影响较小。2型糖尿病患者的温度调节能力受损，可能是温度补偿特征受损[7]。除生物节律受温度影响外，上述节律因子还参与糖尿病的糖脂代谢、胰岛素分泌等生理过程。Bmal1和Clock是生物钟核心环路的正反馈调节因子，可诱导Per/Cry等参与胰岛素生物合成、转运以及葡萄糖刺激的胰岛素分泌相关转录因子的激活，从而影响糖代谢过程[22]，Bmal1基因多态性更是与空腹血糖升高相关，诱导糖尿病发生[23]。

综合动物实验与分子实验结果，研究发现各组间体温节律的变化，在相应分子表达上呈现相似的趋势，模型组显著低于正常对照组，而阴虚证组和糖尿病阴虚证组表达上升，六味地黄汤反证了阴虚证具有节律表现的同时，也有上调节律因子的趋势。中枢组织和外周组织的节律因子的表达有异同，共同可见有Clock、Cry蛋白的变化。节律调控中枢下丘脑中，主要的变化因子是Per2和Cry2。不同的是，在外周靶器官中，主要的调控因子是Bmal1、Per3和Cry1。通过分子实验证实生物钟机制在糖尿病阴虚证中的重要作用。生物钟分子的正常表达可以使机体表现出稳定节律，生物钟分子表达下降则容易导致节律紊乱[24]。如2型糖尿病小鼠体温节律波动规律不明显，相应节律分子表达下降；而糖尿病阴虚证小鼠的生物钟蛋白表达上调，与机体表现出稳定的“午后潮热”“五心烦热”相关。研究表明，生物钟和温度周期具有密切联系，长时间日光照射可导致生物节律蛋白降解，但稳定的温度周期可是的核心生物钟蛋白恢复振荡，重启生物钟。

综上，2型糖尿病阴虚证动物模型显示出具有“潮热”的体温节律变化，体现在肛温、双上肢爪心温度的8：00“低”、15：00“高”、20：00“低”节律波动，肝脏和下丘脑生物节律改变可能是这种体温节律变化的重要机制。以生物节律为切入点探讨2型糖尿病阴虚证的证候本质的研究较为零散，不同疾病证候中的研究报道亦有不同，但是其可以扩展我们对疾病证候科学内涵的认识，并拓宽中医证候研究的新思路，也为中医证候新药的研究和开发奠定了基础。

本研究存在一定不足，如所构建的阴虚证模型是旨在模拟疾病证候模型，不能完全模拟真实世界患者所患证候特征；其次，本研究所应用的啮齿动物的生物节律与人类生物节律生存在差异，不能完全模拟现代人疾病证候下出现的节律紊乱，但也有大量文献应用啮齿类动物进行人类节律紊乱相关实验研究[25-28]，这些问题也将在今后的实验及临床研究中不断深入研究。综上所述，本研究结果丰富了中医糖尿病阴虚证证候特征的实质研究以期对中医证候实质及生物节律相关研究进行，为今后进一步的研究储备了有益的依据。