巢式多重聚合酶链反应快速诊断儿童脑膜炎/脑炎

石迎迎 潘 芬 孙 燕 王 春 蒋 婕 于方圆 张天栋 秦惠宏 张 泓

（上海市儿童医院 上海交通大学附属儿童医院检验科，上海 200040）

脑膜炎/脑炎是发病迅速、病情进展快、致死率高的临床急症[1]。进展快速的细菌性脑膜炎24～48 h即可致命[2]。有多种原因可诱发脑膜炎/脑炎，包括感染性和非感染性因素。中枢神经系统感染通常由细菌、病毒或真菌引起，其中最常见的是病毒性脑炎。儿童病毒性脑炎发病率约为16/10万，显著高于成人[3]。中国疾病预防控制中心流行病学调查数据显示，5岁以下儿童细菌性脑膜炎总体发病率显著高于成人[4]。因此，儿童脑膜炎/脑炎的快速诊断具有极其重要的意义。脑脊液培养是鉴别细菌和非细菌性脑炎/脑膜炎的常规方法[5]，也是诊断疾病的金标准，但其病原体检出率偏低，检测周期较长，易受多种因素影响[6]。由于病毒培养的特殊性，临床对病毒性脑膜炎/脑炎的诊断主要依靠实验室数据，但常规方法敏感性和特异性均不理想。寻找高特异性和高敏感性的中枢神经系统感染病原体检测新方法迫在眉睫。

巢式多重聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）可在1 h内同时检测多种病原体，包括病毒、细菌和真菌，样本用量少，敏感性和特异性高[7]。本研究拟采用巢式多重PCR检测中枢神经系统感染患儿脑脊液样本，分析这种快速病原体检测方法在儿童脑膜炎/脑炎诊断中的价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2017年5月—2020年5月上海市儿童医院神经内科、新生儿科、重症医学科、血液科、消化与感染科临床诊断为中枢神经系统感染或疑似中枢神经系统感染患儿的脑脊液样本82例，所有患儿年龄均<18岁，诊疗记录完整。中枢神经系统感染或疑似中枢神经系统感染诊断标准参考文献[8-9]。排除标准：1）患儿有先天性疾病或慢性疾病；2）患儿在脑脊液样本采集时已有其他无法排除的中枢神经系统疾病；3）脑脊液样本量低于检测要求。本研究经上海市儿童医院伦理委员会审查批准（2019R031-F01），所有患儿监护人均知情同意。

1.2 方法

收集所有患儿脑脊液常规和生化检测结果（脑脊液白细胞计数、葡萄糖、蛋白、氯、乳酸脱氢酶）、脑脊液培养结果和本次住院天数、抗菌药物使用天数、是否使用阿昔洛韦、是否合并感染、是否发热和临床结局等临床资料。采用法国生物梅里埃公司Filmarray2.0多重核酸检测系统及配套ME panel检测14种病原体，包括大肠埃希菌K1株、流感嗜血杆菌、单核细胞增生性李斯特菌、脑膜炎奈瑟菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、新生隐球菌/格特隐球菌、巨细胞病毒、肠道病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、人疱疹病毒6型、人双埃可病毒、水痘-带状疱疹病毒。严格按说明书要求进行操作。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行数据分析。计数资料用例或率表示，组间比较采用Fishers精确检验。正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。偏态分布计量资料以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示。以P<0.05为差异有统计学 意义。

2 结果

2.1 82例患儿基本临床资料

82例患儿中，男49例、女33例，年龄（3.52±3.95）岁。临床诊断为细菌性中枢神经系统感染30例，病毒性中枢神经系统感染23例，疑似中枢神经系统感染29例；好转76例，未愈4例，死亡2例。具体情况见表1。

表1 82例患儿基本临床资料

2.2 巢式多重PCR检测结果

82例患儿中，临床明确诊断53例，其中巢式多重PCR检出31例（58.5%）阳性病例；30例临床明确诊断为细菌性中枢神经系统感染的患儿中，巢式多重PCR仅检出11例（36.7%）细菌阳性；23例临床明确诊断为病毒性中枢神经系统感染的患儿中，巢式多重PCR检出20例（87.0%）病毒阳性；巢式多重PCR病毒阳性检出率显著高于细菌阳性检出率（P<0.05）。病毒阳性患儿中，肠道病毒感染率最高；细菌阳性患儿中，无乳链球菌感染率最高。1～12个月、3～6岁患儿病毒感染率最高，<1个月患儿细菌感染率最高。见图1。

图1 巢式多重PCR病原体检出情况

2.3 不同类型病原体感染患儿相关指标比较

细菌组脑脊液白细胞计数、蛋白水平、乳酸脱氢酶水平、抗菌药物使用天数和住院天数均高于病毒组，脑脊液葡萄糖水平和阿昔洛韦使用率均低于病毒组（P<0.05）。脑脊液中氯含量2个组差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 病毒组、细菌组相关指标比较

2.4 巢式多重PCR与培养法、实验室指标判断结果比较

巢式多重PCR与培养法判断细菌性脑膜炎/脑炎的一致性较好（Kappa=0.659，P<0.001），见表3。2种方法具体细菌种类检出情况见表4。

表3 巢式多重PCR与培养法一致性分析 例

表4 巢式多重PCR与培养法细菌鉴定结果 株

巢式多重PCR与实验室指标判断病毒性脑膜炎/脑炎的一致性分析较好（Kappa=0.737，P<0.001）。见表5。

表5 巢式多重PCR与实验室指标判断的一致性分析 例

3 讨论

目前，我国最常见的细菌性脑膜炎病原菌是肺炎链球菌、无乳链球菌、大肠埃希菌，3月龄内儿童细菌性脑膜炎主要病原菌为无乳链球菌和大肠埃希菌[10]。本研究中，细菌阳性患儿无乳链球菌感染率最高，且多为<1个月患儿。巢式多重PCR细菌检出率低的原因是其检测细菌的覆盖范围有限，特异性高说明其准确性高，假阳性率低，可以准确检出检测系统覆盖的病原体。有研究发现，我国病毒性脑炎或脑膜炎最常见的病毒病原体为肠道病毒[11]，与本研究肠道病毒检出率最高的结果一致，也与浙江省疾病预防控制中心的调查结果相似[12]。

对于疑似细菌性脑膜炎患儿，一般推荐入院后1 h内即使用抗菌药物，并推荐将三代头孢菌素作为初始经验治疗用药方案之一[13]。本研究检出1例单核细胞增生性李斯特菌感染患儿，该菌对头孢菌素类抗菌药物天然耐药[14]，提示快速多重分子检测能够减少经验性抗菌药物的不当使用。病毒性脑膜炎/脑炎患儿中，单纯疱疹病毒脑炎患儿一般预后最差，未经治疗患儿病死率为70%～80%，即使进行特定的抗病毒治疗，病死率仍高达30%[15]。因此，儿童病毒性中枢神经系统感染需要早诊断，及时进行有效干预[16]。快速的分子诊断方法能够快速鉴定病原体，有效避免患儿不良预后，缩短住院时间[17]。对于病原不明的病毒性脑炎或疑似单纯疱疹病毒性脑炎，在没有明确的病原学检查结果的情况下，推荐先使用阿昔洛韦治疗[18]。儿童中枢神经系统病毒感染需要早期诊断，并及时采取有效的干预，但据报道，仍有近50%的病毒性脑炎患儿因无法获得明确的病原学结果而延误治疗[19]。本研究发现，肠道病毒阳性患儿阿昔洛韦使用率达70.00%（7/10），总体来说，病毒组阿昔洛韦使用率为60.87%，细菌组仅为10.00%。因此，快速多重分子检测技术的应用迫在眉睫，可短时间内帮助临床判断病毒感染情况，从而对症治疗，减少阿昔洛韦经验性使用。

脑脊液实验室检测是目前辅助诊断儿童中枢神经系统感染的必要依据，肠道病毒、人疱疹病毒6型等导致的中枢神经系统感染患者脑脊液白细胞计数不升高[20]，但也有部分细菌性脑膜炎患者脑脊液白细胞计数不升高的报道[21]。本研究共检出7例根据实验室指标判断为阴性的样本，均为病毒感染，这一结果表明，如果单纯采用脑脊液实验室指标判断儿童中枢神经系统感染，有漏诊或误诊风险。

然而，本研究结果显示，巢式多重PCR阴性样本中，有2例培养出细菌，其病原体种类不在检测系统覆盖范围内。提示巢式多重PCR检测仍有一定的局限性，需要进一步优化。建议联合送检快速多重分子检测和脑脊液培养，并结合其他辅助检查，以更大程度发挥快速多重分子检测的诊断价值[22]。

综上所述，巢式多重PCR具有快速，操作简便，结果可靠，可同步检出多种病原体的优势，可弥补传统病原学检测方法的不足，值得在临床推广。