CRISPR/Cas13系统用于病原体检测的研究进展

赵亚楠 曹啟新 闫 彦 李晓聪 赵建平 肖伟利

（内蒙古自治区人民医院检验科，内蒙古 呼和浩特 010010）

近年来，新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）、埃博拉病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒等各种病原体严重危胁着公共卫生安全，快速、有效的病原体检测是预防疾病传播的重要途径。然而，目前常用的病原体检测方法，如聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、基因芯片、恒温扩增和基因测序，操作复杂、设备昂贵，无法满足基层医疗和贫困地区的需求。因此，急需开发一种灵敏度高、特异性强、快捷、简便的新一代检测技术。

成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）/成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein，Cas）是细菌和古生菌中普遍存在的一段重复序列，能够在向导RNA（single guide RNA，sgRNA）引导下将Cas蛋白与靶序列结合，并对其进行特异性切割，从而抵御外源物质的入侵[1]。近年来，CRISPR/Cas系统发展迅速，在基因调控、疾病治疗、植物育种等领域有着广阔的应用前景，其中CRISPR/Cas9系统能够在DNA基础上对靶序列进行高效、精准的编辑，已广泛应用于基础研究、临床治疗等领域[2-5]。但CRISPR/Cas9仅能对DNA进行调控，对RNA的特异性较低，且会出现脱靶效应，甚至可能会对细胞基因组造成损伤，因此在应用方面存在一定的安全隐患。而CRISPR/Cas13系统以Cas13酶特异靶向并剪切单链RNA，同时对周边RNA进行“附带切割”，基于其精准的靶向性和酶切割能力，已被开发为新一代诊断技术，具有灵敏度高、特异性强等优点，在病原微生物检测方面具有广阔的应用前景[6-8]。本文对基于CRISPR/Cas13系统的病原体检测的研究进展进行综述，为后续研究提供参考。

1 CRISPR /Cas13系统简介

根据Cas蛋白组成和发挥作用方式的不同，可将CRISPR/Cas系统分为两大类：一类系统可分为Ⅰ型和Ⅲ型系统，其核酸酶需要多种Cas蛋白酶集合形成复合物才能发挥作用；二类系统可分为Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型系统，其核酸酶只需要单一Cas蛋白即可发挥效用[9-10]。Ⅱ型（Cas9）和Ⅴ型（Cas12）主要对DNA具有靶向性，在基因编辑、肿瘤治疗等方面被广泛研究[4，11]。Cas13属于二类Ⅵ型系统，含有2个高等真核生物和原核生物核苷酸结合域（higher eukaryote and prokaryote nucleotidebinding domain，HEPN）结构，是一种靶向剪切RNA的新型CRISPR系统酶。Cas13具有加工处理向导RNA（CRISPR RNA，crRNA）和crRNA引导下靶向剪切单链RNA的双重核酸酶活性，能够特异性识别并剪切RNA片段，同时还具备非特异性RNA核糖核苷酸酶（RNA ribonuclease，RNase） 活性，可对周边的RNA片段进行无差别的“附带剪切”。根据Cas蛋白功能的不同，Ⅵ型系统又可分为4种亚型，分别为Ⅵ-A、Ⅵ-B、Ⅵ-C、Ⅵ-D，其中Ⅵ-A即为Cas13a，含有Cas1和Cas2蛋白，高分辨率电镜检测结果显示Cas13a具有“双瓣叶”球状蛋白结构，由1个crRNA识别叶和1个核酸酶叶组成[11]。Cas13a与靶序列结合，可引起构象变化，催化HEPN 1和HEPN 2结合部位位点活化，导致靶序列在结合区域的外部被切割（顺式切割），同时非特异性切割周边其他RNA（反式切割）[12]。Ⅵ-B即为Cas13b，不含Cas1和Cas2，根据Cas13b转座子上携带的附属蛋白基因型的不同，可分为Ⅵ-B1和Ⅵ-B2型[13]。Ⅵ-B1的附属蛋白是Csx27，Ⅵ-B2的附属蛋白是Csx28，Cas13b蛋白酶活性受Csx27/Csx28影响，Csx27表现为抑制，Csx28表现为增强[13]。Ⅵ-D即为Cas13d，由crRNA、CRISPR系统酶（Cas1、Cas2、Cas13d）和附属蛋白WYL1组成，Cas13d的相对分子质量远小于其他3种核酸酶，可以仅依靠Cas13d上最小序列，即二级结构靶向RNA，附属蛋白WYL1可以正向诱导酶切活性，由于Cas13d具有较强的靶向切割能力和酶切活性，被广泛应用于基础研究中[14]。目前关于Cas13c的报道较少。

2 CRISPR /Cas13系统在病原体检测中的研究进展

2.1 在病毒检测中的研究进展

EAST-SELETSKY等[15]在CRISPR/Cas13a系统中加入结合有荧光基团和淬灭基团的RNA荧光报告分子，在其被切割前淬灭基团发挥作用，使RNA荧光报告分子不发射荧光；当Cas13a被靶序列激活时，“附带切割”RNA荧光报告分子，致使RNA链断裂，荧光基团被激活，并释放荧光信号，通过收集荧光信号即可进行特定核酸检测，但该方法的灵敏度较低，只达到pmol/L级，尚不能满足临床检测需求。2017年，GOOTENBERG等[16]在先前研究的基础上，结合重组聚合酶（recombinase polymerase amplification，RPA）扩增技术和T7核糖核酸聚合酶转录技术，发明了特异性高灵敏度酶报告解锁（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking，SHERLOCK）技术，并成功检测出寨卡病毒和登革热病毒的特定毒株。2018年，GOOTENBERG等[17]又根据CRISPR酶学的特点进一步优化了SHERLOCK技术，第2代SHERLOCK技术与CRISPR相关蛋白Csm6结合，将灵敏度从pmol级提升至amol级；针对不同的Cas蛋白所结合的crRNA具有特异性，可以进行不同病原体的Cas13多通路检测；结合侧向层析试纸条技术，可在短时间内呈现结果，采用冻干技术可制备成易于携带的即时检测（point-of-care testing，POCT）试剂。MYHRVOLD等[18]研发出HUDSON技术，用于病毒核酸的保护和释放，该技术的原理为：利用加热和化学还原方法，可同时裂解病毒颗粒，并灭活体液中的高水平核糖核酸酶，免去核酸提取的步骤。将HUDSON和SHERLOCK结合，可直接检测体液中的病毒DNA/RNA，无需特殊设备，1～2 h即可出结果，大大提高了POCT的效能。有研究结果显示，基于SHERLOCK技术可检出EB病毒、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、禽流感病毒、非洲猪瘟病毒等[19-23]，灵敏度高，特异性强，与其他病原体无交叉反应。郭悦等[24]将CRISPR/Cas13检测与重组酶介导的扩增技术（recombinase aided amplification，RAA）结合，39 ℃条件下40～52 min可检出8种输入性传染病病原体，灵敏度可以达到1～10拷贝/μL，临床样本中的病原体被全部检出。目前，实时荧光定量PCR技术是检测SARSCoV-2的金标准，广泛应用大规模筛查，检测限低至1拷贝/μL，但最新病毒动力学模型表明，相对于灵敏度而言，高频率检测和快速诊断才是减少病毒传播的关键[25]。FOZOUNI等[26]将CRISPR/Cas13a与手机显微镜结合，进行SARSCoV-2检测，无需预扩增即可直接检测鼻拭子中的RNA，通过手机摄像头读取荧光信号，灵敏度达到100拷贝/μL，且能在5 min内提供准确结果。在大规模筛查中，基于CRISPR/Cas13a系统的SARS-CoV-2检测在时效、成本、便携上有着巨大的优势。

2.2 在细菌检测中的研究进展

传统病原菌检测技术通常包括微生物分离培养与鉴定、免疫学检测和基于核酸检测的分子生物学诊断技术，分离培养与鉴定周期长，无法满足临床快速检测病原菌的需求，而免疫学和分子生物学诊断技术对仪器、人员要求较高，操作较复杂，所需成本高，无法满足基层医院的需要。2017年，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）发布了适用于发展中国家病原体检测方法的标准，要求具有经济、高灵敏度、高特异性、操作简单、快速稳定和易储运的特点[27]。因此，迫切需要开发一种灵敏、特异、快速、便捷的新型病原菌检测平台。JIANG等[28]将PCR与CRISPR/Cas13结合，用于检测沙门菌，显示出优异的敏感性，2 h内可以检出至少10个沙门菌基因组DNA（1 amol/L或10 CFU/mL），特异性良好，与其他常见的食源性细菌没有交叉反应。该方法能够灵敏且准确地检测沙门菌，为食品中食源性病原体的检测提供了一种新的策略，突破了传统方法耗时且高度依赖巨大人力和物力资源的局限。JIANG等[28]还利用CRISPR/Cas13系统检测B族链球菌（group BStreptococcus，GBS），与基于培养和PCR的检测方法相比，这种新型GBS检测方法显示出优异的诊断性能，敏感性和特异性被大大提高，有望成为GBS快速筛查的新型POCT方法。AI等[29]利用SHERLOCK技术成功检测出结核分枝杆菌，与GeneXpert法具有相同的敏感性。黄明耀等[30]利用CRISPR/Cas13a技术在2 h内快速检测布鲁菌，敏感性和特异性均为100%，检测下限接近10 fg/μL，成功解决了临床布鲁菌检测周期长、患者无法得到及时救治的难题。苏璇等[31]利用CRISPR/Cas13a辅助RAA技术检测食品中的金黄色葡萄球菌，其灵敏度为101CFU/mL，远高于实时荧光定量PCR（102CFU/mL），且检测时间仅需30 min，大大提高了对食源性疾病暴发的应急检测能力，为金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病早期诊断提供了有力的支持。

2.3 在真菌检测中的研究进展

近年来，随着免疫抑制剂、侵入性诊疗的广泛应用，真菌感染率逐年上升，已成为医院感染的主要病原体之一。传统真菌分离培养方法检测周期长，患者预后不良风险较高，因此快速、准确的检测技术对临床真菌感染诊断有着重要的意义。LI等[8]利用SHERLOCK检测平台建立了烟曲霉菌的鉴定方法，结果显示，CRISPR/Cas13a技术能快速鉴定出烟曲霉菌，其敏感性和特异性与荧光定量PCR一致。宏基因组测序敏感性较高，但该技术对操作者的要求较高，并且需要使用GenBank数据库进行核酸序列比对，使该方法局限于实验室诊断而不能在临床中广泛使用，尤其是在缺乏实验室诊断条件的地区。因此，基于CRISPR/Cas13a系统的检测技术可用于初步筛查，为临床快速确定曲霉菌感染提供依据。这为未来开发基于CRISPR/Cas13a系统的新型真菌感染检测方法奠定了基础。

2.4 在寄生虫检测中的研究进展

寄生虫实验室检测主要以病原学检查、免疫学检测和分子生物学检测为主。对于病原学检查而言，影响因素较多，寄生虫感染阶段、寄生部位和样本采集的方法、操作、部位不同均容易导致漏诊，而且对检测人员要求较高，需要有丰富的知识和经验。相较于传统的病原学检查，免疫学检测和分子生物学检测有更高的敏感性和特异性，且操作相对简便、易行，结果客观、准确，重复性好，结合病原学检查结果，可以极大地提高寄生虫的检测效率[32]。随着CRISPR/Cas13系统在病毒、细菌等病原体检测中的广泛应用，目前该系统也逐步应用于寄生虫检测。余复昌[33]建立了基于RPA反应和CRISPR/Cas13a系统的检测微小隐孢子虫的“一管法”快速检测方法，具有高效、特异、稳定的特性，在资源相对匮乏的偏远地区具有广阔的应用前景。LEE等[34]采用SHERLOCK检测平台对恶性疟原虫（即镰刀疟原虫）进行检测，可同时鉴别恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫；该方法优化了核酸提取过程，能够在60 min内检测出每毫升血液中的2个疟原虫，符合WHO建议的检测灵敏度。

3 总结与展望

CRISPR/Cas13系统目前已被开发为一种新型的分子诊断工具，为病原体的检测打开了新思路。该系统具有高灵敏度、高特异性、快速、便捷、成本低的特点，可以实现快速POCT，在病原体检测领域有着广阔的应用前景。与基于PCR的传统分子诊断技术相比，基于CRISPR/Cas13系统的核酸检测技术具有高灵敏度和单碱基错配特异性高的特点，如SHERLOCK技术可以将灵敏度提高到amol/L级别，无需精密的仪器设备、昂贵的试剂和专业人员；SHERLOCK试纸条可以大批量生产，室温储存，保质期长，可在基层医疗机构和偏远地区实现病原体的快速筛查；借助生物传感器实现可视化信号读取，大大降低了检测成本，能够实现快速定量检测和多重检测。ACKERMAN等[35]开发了一种用于可扩展的多路复用病原体检测平台，即核酸多重评估的组合阵列反应（combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids，CARMEN），将CARMEN和Cas13检测（CARMEN-Cas13）结合，可在单个阵列上对4 500多个靶crRNA对进行测试，能够区分SARSCoV-2等169种可感染人类的病毒，并可对甲型流感病毒株进行全面的亚型分析，完成数十种人类免疫缺陷病毒耐药突变株鉴定。

然而，目前基于CRISPR/Cas13系统的病原体的诊断技术仍面临许多挑战。为了提高检测灵敏度，许多基于CRISPR/Cas13系统的核酸检测技术均加入了RPA扩增技术，该技术容易引起非特异性扩增，造成假阳性或假阴性的结果，可能需要通过NGS等较为成熟的技术验证结果的准确性。多种引物的加入会使CRISPR/Cas13生物传感器体系的建立和检测过程复杂化，限制检测速度，为实现POCT增加难度。优选Cas13蛋白、设计crRNA引物是建立高效CRISPR/Cas13生物传感器的基础和难点，仍需进一步研究。大多数基于 CRISPR/Cas13系统的检测平台只能实现对单一病原体的定性检测，难以实现定量检测与高通量检测。因此，未来还需要对基于CRISPR/Cas13系统的病原体检测技术进一步优化，构建快速定量检测和高通量检测平台是未来研究的重点。