过表达miR-132对糖尿病视网膜病变Müller细胞的保护作用及相关机制

吕佳 冀杰 邱波

(广州中医药大学第二附属医院眼科,广东 广州 510000)

糖尿病视网膜病变属糖尿病并发症之一,视网膜病变严重影响患者视功能,是目前致盲率较高的疾病之一〔1〕。糖尿病视网膜病变发生后不仅仅表现为视网膜微血管病变,还表现为Müller细胞结构、功能改变〔2〕。既往研究发现,微小RNA(miR)家族参与糖尿病视网膜病变发生过程,miR-132属于miR家族成员之一,研究认为其与糖尿病血管新生密切相关,可能为诱发糖尿病视网膜病变的因素〔3〕。本文探讨过表达miR-132对糖尿病视网膜病变Müller细胞的保护作用及相关机制。

1 资料与方法

1.1研究动物 选取10只SPF级大鼠,8～10周龄,平均体质量(215.35±20.26)g,由冠科生物技术(中山)有限公司提供,动物许可证号：SYXK(粤)2020-0240,在22～28 ℃、相对湿度为50%～60%的清洁环境下饲养7 d,明暗周期为12 h。本研究操作均严格参照实验动物管理条例相关规定进行。

1.2糖尿病视网膜病变Müller细胞分离培养 参照文献〔4〕构建糖尿病视网膜病变大鼠模型,10只大鼠均给予高脂饲料喂养14 d,尾部静脉注射50 mg/kg链脲佐菌素(美国Sigma公司),注射72 h后测定空腹血糖,当空腹血糖≥16.7 mmol/L时表明糖尿病建立成功。继续饲养1 w后,对大鼠麻醉处理,颈部脱臼法处死,摘取眼球,在显微镜下剥取视网膜,均匀分为2等份,其中1等份做组织切片,行苏木素-伊红(HE)染色,观察视网膜病理变化,若视网膜神经节细胞排列较为紊乱,神经纤维层肿胀,毛细血管扩张淤血,则说明糖尿病视网膜病变模型建立成功(图1)。建模成功后取建模成功的另外1等份视网膜,使用0.25%胰酶消化,消化10 min后使用400目筛网过滤、离心(1 000 r/min,离心5.5 min),弃除上清液后使用含10%胎牛血清的低糖DMEM对细胞密度进行调整,调整为3×106/L,接种在25 cm2培养瓶中,当细胞密度为90%时做传代培养(图2),细胞贴壁生长,待细胞生长至第三代时,进行后续实验。

图1 大鼠视网膜病变(HE染色,×200)

图2 Müller细胞生长情况(×200)

1.3分组及转染 查找miR-132序列,由上海市吉凯生物科技有限公司设计miR-132抑制物(miR-132 inhibitor,沉默)、miR-132模拟物(miR-132 mimic,过表达)。将所培养的第三代Müller细胞分为对照组、沉默组、过表达组,其中对照组不做任何处理,沉默组使用脂质体LipofectamineTM2000试剂盒做miR-132沉默(miR-132 inhibitor)转染,过表达组做脂质体LipofectamineTM2000试剂盒miR-132过表达(miR-132 mimic)转染。转染24 h后观察各组细胞变化。

1.4miR-132转染效率鉴定 取细胞,采用Trizol试剂提取细胞总RNA,测定RNA浓度,进行RNA反转录,之后采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定miR-132转染效率。采用Veriti7500 RT-PCR仪行PCR,反应体系：0.5 μl上下游引物、1 μl cDNA模板、10 μl SYB Green,2.5 μl 10×缓冲液,加蒸馏水至20 μl。反应条件：95 ℃预变性10 min、95 ℃变性10 s、60 ℃退火20 s,72 ℃延伸10 min,共进行40个循环。采用2-ΔΔCt方法计算出需要检测的miR-132表达量,每组数据各测3次,取平均值。miR-132上游引物：5′-TAACAGTCTACAGCCATGG-TCG-3′,下游：5′-CTTCTTGCGGTCTTGCCATTCC-3′;内参β-Actin上游引物：5′-GCGAGAAGATGACCCACCACC-3′,下游：5′-ATGTCACGCACGATTTCCTATTA-3′。

1.5细胞存活情况评价 采用CCK-8法测定各组细胞存活率,取对数生长期细胞,将其接种于96孔板内,细胞浓度为2×107/L,37 ℃培养,2 h后使用酶标仪记录450 nm波长处的吸光值,取其中4孔光密度(OD)均值,计算各组细胞24、48、72 h存活率,细胞存活率(%)=(OD处理组-OD空白组)/(OD对照组-OD处理组)×100。

1.6细胞凋亡情况评价 采用TUNEL法检测细胞凋亡率,在荧光显微镜下对细胞凋亡数进行观察计数,经洗涤、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色封片后的细胞核分别呈现为阳性(绿色荧光)和阴性(蓝色荧光),之后计算细胞凋亡率,细胞凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数×100%,重复进行3次,取平均值。

1.7细胞肿瘤抑制因子(PTEN)/磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路蛋白检测 采用Western印迹检测各组细胞中PTEN/PI3K/AKT通路蛋白p-PTEN、p-PI3K、p-AKT、p-促凋亡蛋白(Bad)、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2表达量,将细胞做10 000 r/min离心10 min,提取上清液,做二喹啉甲酸(BCA)蛋白定性检测,取50 μg蛋白,加入值2×十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶缓冲液中,100 ℃下加热5 min促使蛋白变性。凝胶电泳、转膜、取膜,4 ℃在5%脱脂牛奶中固定、封闭1 h,以1∶1 000比例使用0.05%～0.10% TBST稀释一抗,加入一抗后4 ℃孵育过夜,0.05%～0.10% TBST洗膜3次,加入1∶10 000的稀释二抗,摇动孵育1 h,做0.05%～0.10% TBST洗膜,二氨基联苯胺(DAB)显色,以GAPDH为内参照,定量分析蛋白表达情况。一抗由武汉菲恩生物科技有限公司提供。

1.8统计学处理 采用SPSS26.0软件进行方差齐性检验、独立样本t检验。

2 结 果

2.1miR-132转染效率鉴定 如表1所示,与对照组相比,沉默组miR-132表达显著降低,过表达组miR-132表达显著升高(P<0.05);与沉默组相比,过表达组miR-132表达显著升高(P<0.05)。说明miR-132转染成功。

表1 各组miR-132转染效率鉴定、细胞存活及凋亡情况比较

2.2各组细胞存活情况对比 如表1所示,与对照组相比,沉默组各时间点细胞存活率明显降低,过表达组各时间点细胞存活率明显升高(P<0.05);与沉默组相比,过表达组各时间点细胞存活率明显升高(P<0.05)。

2.3各组细胞凋亡情况对比 如表1、图3所示,与对照组相比,沉默组细胞凋亡率明显升高,过表达组细胞凋亡率明显降低(P<0.05);与沉默组相比,过表达组细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。

2.4各组细胞PTEN/PI3K/AKT通路蛋白表达对比 如表2、图4所示,与对照组相比,沉默组p-PTEN表达量升高,p-PI3K、p-AKT、p-Bad、Bcl-2表达量降低,过表达组p-PTEN表达量降低,p-PI3K、p-AKT、p-Bad、Bcl-2表达量升高,均有统计学差异(均P<0.05);与沉默组相比,过表达组p-PTEN表达量降低,p-PI3K、p-AKT、p-Bad、Bcl-2表达量升高,均有统计学差异(均P<0.05)。

表2 各组细胞PTEN/PI3K/AKT通路蛋白表达对比

3 讨 论

糖尿病视网膜病变发展过程中,糖尿病视网膜中的Müller细胞既存在增殖又存在凋亡表现,在疾病发生早期,Müller细胞核结构改变,并未有明显的视网膜周细胞、毛细血管内皮细胞病理改变现象,但随着疾病的进展,机体处于长期的高糖状态,此时Müller细胞表现为超微结构改变和细胞器损伤〔5,6〕。研究发现〔7,8〕,在持续高糖环境下,视网膜Müller细胞明显受到损伤,分析其原因可能与在机体长期处于高糖状态下时有害物沉积至细胞中,进一步损伤细胞,最终降低Müller细胞存活率,促进其凋亡。

临床研究发现〔9,10〕,miR参与机体多种病理生理过程,包括肿瘤形成、细胞增殖、凋亡、炎症反应及心血管疾病、糖尿病等。临床研究认为,多种miR参与糖尿病的发生发展。研究发现〔11〕,miR-12与葡萄糖代谢有关。研究显示〔12〕,miR-132具有多重作用,miR-132介导了视网膜微血管内皮细胞对部分基因的调节。另外最近一项研究显示〔13〕,miR-132在糖尿病视网膜病变中表达明显降低,认为miR-132可能经丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)1/3信号通路参与糖尿病视网膜病变的发生,且MAPK1/3信号通路可能为保护视网膜神经节细胞相关机制。上述研究均提示miR-132可能参与糖尿病视网膜病变的发生发展过程。本文结果提示,过表达miR-132可能经过抑制Müller细胞凋亡,促进存活而发挥保护作用。

PTEN/PI3K/AKT通路广泛存在于各细胞中,其主要调控细胞增殖、凋亡等发挥其作用,研究显示,当PTEN/PI3K/AKT通路激活后可促进细胞增殖,抑制凋亡,AKT可经调节细胞周期,发挥促进细胞增殖的作用〔14,15〕。而PI3K在被激活后可产生较多的下游信号分子,促进信号传导,而进一步增强其作用〔16～18〕。在糖尿病视网膜病变发生过程中上述信号通路失活,当经外界手段干预后,可激活此信号通路,而下游相关靶点因子表达被改变,最终改变视网膜病变,保护视网膜组织,可作为糖尿病视网膜病变治疗靶点〔19〕。PTEN属于PI3K/AKT通路中的负调节因子,其可促使PIP3磷酸化使其低表达,而抑制此信号通路活化,参与细胞凋亡过程〔20,21〕。研究显示〔22〕,PTEN/PI3K/AKT通路中的PTEN参与糖尿病视网膜病变后感光器细胞凋亡,当其被抑制后可直接激活PI3K/AKT而抑制线粒体活化,最终发挥其抑制视网膜神经元凋亡,阻碍疾病进展。鉴于上述背景,推测PTEN/PI3K/AKT通路与过表达miR-132抑制Müller细胞凋亡、促进存活相关,分析细胞中各信号通路蛋白表达情况。本研究结果提示,过表达miR-132可能经调控PTEN/PI3K/AKT通路,抑制PTEN表达,促进PI3K、AKT、Bad、Bcl-2表达而发挥保护Müller细胞的作用,表现为细胞存活率升高、凋亡率降低。

综上,过表达miR-132具有保护糖尿病视网膜病变Müller细胞的作用,其作用机制可能与调控PTEN/PI3K/AKT通路、抑制细胞凋亡、增加存活率相关。