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基于ERK信号通路探讨鹿茸大补汤颗粒对哮喘缓解期豚鼠的调控及作用机制

2023-11-07丁云录郑明昱南敏伦金丽娜延光海赫玉芳

中国老年学杂志 2023年21期
关键词:鹿茸豚鼠气道

丁云录 郑明昱 南敏伦 金丽娜 延光海 赫玉芳

(1长春中医药大学,吉林 长春 130117;2延边大学)

鹿茸大补汤为收载于李济马的《东医寿世保元》的朝医经方,由鹿茸、麦冬、薏苡仁、山药、麻黄、杏仁、天冬、五味子八味药材组成,具有健肺止咳,补肺益精的功效,为治疗太阴人哮喘缓解期的有效方剂,在既往的研究中,通过鹿茸大补汤治疗,支气管哮喘缓解期患者临床症状和体征显著改善,临床疗效显著,鹿茸大补汤能够抑制气道炎症,可达到标本兼治的功效〔1,2〕。细胞外调节蛋白激酶(ERK)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的一员,是调节细胞生长、发育及分裂的信号网络枢纽,在哮喘气道炎性反应中发挥着重要的作用〔3〕。本实验从豚鼠肺组织病理损伤程度上衡量鹿茸大补汤颗粒对哮喘缓解期的治疗作用,通过检测ERK信号通路上的作用因子激活蛋白(AP)-1、原癌基因蛋白(C-Fos)的表达情况及其下游因子白细胞介素(IL)-4、IL-5的含量变化来探讨鹿茸大补汤颗粒对哮喘缓解期的治疗机制,明确鹿茸大补汤颗粒为临床治疗提供实验依据和安全有效的朝医药疗法。

1 材料与方法

1.1实验动物 实验用3周龄Hartley豚鼠,普通级,雌雄各半,体质量200~230 g,分笼饲养,室温(21±2)℃,相对湿度50%~60%,通风良好,室内12 h明暗自动切换,自由摄食、饮水。动物合格证号:SCXK-(吉)2018-0006,购于长春市隆盛实验动物科技有限公司。

1.2药物及试剂 鹿茸大补汤颗粒剂,性状:棕褐色颗粒,批号:20191001,吉林省中医药科学院植物化学研究中心提供。地塞米松片,规格:0.75 mg×100片/瓶,批号:1903052,安徽金太阳生化药业有限公司产品。卵白蛋白(OVA,上海源叶生物科技,M04J10592182);组织固定液(广州维格斯生物科技,18121204)。免疫球蛋白(Ig)E、IL-4、IL-5、干扰素(IFN)-γ酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国RD,E20191101A);C-Fos 抗体(Santa Cruz,11364); AP-1抗体(Santa Cruz,D1375);5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液(boster,14A16B04);抗体稀释液(boster,13G25C16)。

1.3仪器 美国UVP ChemiDoc-It 510凝胶成像分析系统(Ultra-Violet Products Ltd);BIO680酶标仪(BIO RAD);OlympusBX51光学显微镜(Olympus);NIS-ELEMNT BR图像分析系统(NIKON);Leica RM2255石蜡切片机(Leica);Leica EG1140石蜡包埋机(Leica)。DYY-6C电泳仪(北京市六一仪器厂);Biofuge Stratos台式高速冷冻离心机(德国贺利氏)。

1.4分组、给药、建立模型〔4~6〕将豚鼠随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组(地塞米松2 mg/kg)、鹿茸大补汤颗粒高、中、低(4.500、2.250、1.125 g/kg)剂量组各8只。鹿茸大补汤颗粒,人口服日用量为30 g,每克颗粒相当于1.5 g生药量,根据体表面积折算豚鼠等效日用量为2.25 g/kg,药效学试验设3个剂量:分别取等效剂量1/2量1.125 g/kg、等效剂量2.25 g/kg、2倍等效剂量2.25 g/kg;地塞米松,豚鼠试验用药效剂量采用人日用量等效剂量的2倍剂量,约为2 mg/kg。观察无异常情况后,开始制备哮喘气道重塑模型。除正常对照组不作任何干预外,其余各组均进行造模。第1天用10% OVA溶液1 ml/只进行腹腔注射致敏,然后从第15天开始用1% OVA溶液进行雾化吸入造模,每天1次,连续7 d,直至各豚鼠出现呛咳,躁动,呼吸频率加速、幅度加大、节律不规整,腹肌痉挛,伏地、活动减少等症状,则提示造模成功。造模成功后,正常对照组、模型对照组灌胃蒸馏水,给药组灌胃相应浓度的药品,连续4 w。

1.5实验取材 治疗结束后,以0.3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉豚鼠,腹主动脉取血,静置30 min,3 000 r/min离心15 min,分离血清。剪取肺右下叶,置于组织固定液中固定。另精确称量切取肺组织200 mg,置于液氮中,供Western印迹蛋白表达实验用。

1.6Western印迹检测〔7,8〕Western印迹法检测AP-1、C-Fos蛋白的表达,取组织200 mg剪碎后,加2 ml裂解液在冰上进行匀浆裂解,12 000 r/min离心10 min后取上清即组织总蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法测定总蛋白浓度。上样缓冲液与蛋白样品按1∶4的比例混匀,沸水加热5 min,蛋白样品充分变性、冷却,2 500 r/min离心30 s,取上清加样进行电泳,每孔上样量10 μl,电压80 V。在冰浴条件下,80 V,300 mA进行转膜。室温摇床下脱脂奶粉(TBST配制5%)封闭,4 ℃过夜。封闭结束后,脱脂奶粉溶液分别和AP-1、C-Fos一抗按200∶1比例配制,进行37 ℃摇床孵育2 h,摇床上TBST洗膜3次(10 min/次);结束后脱脂奶粉溶液分别和AP-1、C-Fos二抗按2 000∶1配制,37 ℃摇床孵育1.5 h,摇床上TBST洗膜3次(10 min/次)。二抗孵育结束后显影,将显影液滴于膜上反应2 min,在凝胶成像仪下曝光成像。

1.7ELISA 取血清,以ELISA检测IgE、IL-4、IL-5、IFN-γ分泌水平,严格按试剂盒说明书操作检测。

1.8病理学观察 豚鼠肺组织标本,置于组织固定液中固定,乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片,进行苏木素-伊红(HE)染色,显微镜下观察豚鼠肺部病理情况。依据肺内炎症变化,将动物肺脏病理变化分级评价:0级:未见肺内炎症细胞浸润,未见肺泡融合,未见肺气肿。1级:可见肺内气道旁轻度炎细胞聚集浸润,肺内间隔内轻度淋巴细胞浸润,肺间隔轻度增宽;2级:可见肺内气道中度炎细胞聚集浸润,肺内间隔内中度淋巴细胞浸润,肺间隔中度增宽;3级:可见肺内气道重度炎细胞聚集浸润,肺内间隔内较多度淋巴细胞浸润,肺间隔严重增宽,肺实变。

1.9统计学处理 采用SPSS17.0软件进行t检验或单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组肺组织AP-1、C-Fos蛋白表达 与正常对照组比较,模型对照组AP-1、C-Fos豚鼠肺组织蛋白表达均显著上调(P<0.01);与模型对照组比较,除鹿茸大补汤颗粒低剂量组外,鹿茸大补汤颗粒高、中剂量组和阳性对照组中AP-1、C-Fos蛋白表达均显著下调(P<0.01,P<0.05)。见表1、图1。

1~6:正常对照组、模型对照组、阳性对照组、鹿茸大补汤颗粒高剂量组、鹿茸大补汤颗粒中剂量组、鹿茸大补汤颗粒低剂量组图1 Western印迹检测肺各组组织AP-1、C-Fos蛋白表达

表1 鹿茸大补汤颗粒对OVA所致哮喘模型豚鼠肺组织AP-1、C-Fos蛋白表达的影响

2.2血清IgE、IFN-γ、IL-4和IL-5检测含量 与正常对照组比较,模型对照组血清中IgE、IL-4、IL-5含量显著升高,IFN-γ含量显著降低(P<0.01,P<0.05)。与模型对照组比较,鹿茸大补汤颗粒高剂量可以明显降低血清中IgE、IL-4、IL-5含量并明显升高IFN-γ含量(P<0.01,P<0.05);阳性对照组和鹿茸大补汤颗粒中剂量可以明显降低血清中IgE、IL-4、IL-5含量(P<0.01,P<0.05);鹿茸大补汤颗粒低剂量可以明显降低血清中IL-4、IL-5含量(均P<0.05)。见表2。

表2 鹿茸大补汤颗粒对OVA所致哮喘模型豚鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4和IL-5含量及肺组织病理损伤程度的影响

2.3肺组织病理损伤程度 模型对照组肺组织病理损伤程度较正常对照组明显升高(P<0.01);鹿茸大补汤颗粒各剂量组豚鼠肺组织病理损伤程度与模型对照组比较,肺内炎症减轻,肺内损伤程度改善。鹿茸大补汤颗粒高、中剂量组和阳性对照组病理损伤程度分级与模型对照组比较,明显减轻(P<0.01,P<0.05)。见表2。

2.4肺组织病理变化 HE染色结果示,正常对照组支气管结构正常,未见炎性细胞浸润;模型对照组支气管炎性细胞浸润明显,黏膜下层增宽,黏膜上皮增生,管腔黏液堵塞支气管,肺间隔增宽;阳性对照组支气管炎性细胞浸润较重,肺间隔增宽;鹿茸大补汤颗粒高、中、低剂量组虽可见炎性细胞浸润等病理表现,但较模型对照组明显减轻。见图2。

3 讨 论

支气管哮喘是一种慢性过敏反应性气道炎症,其发病机制为气道的过敏反应性炎症、变态反应、气道高反应及气道重构等,ERK信号通路在哮喘气道炎性反应中发挥着重要的作用,参与了支气管哮喘发病的各个环节〔9,10〕。ERK信号通路是细胞内非常重要的一条信息通路,在细胞增殖分化方面起着至关重要的作用,参与调控细胞周期进程和促炎症细胞因子表达,异常激活的ERK会促进肿瘤和炎症性疾病的发生发展。AP-1处于ERK信号通路的下段,在人体的各种组织细胞上均有表达,是体内重要的核转录因子,主要由原癌基因编码的蛋白质C-Fos和C-Jun组成。AP-1作为转录因子,通过与DNA上相应的靶序列结合参与细胞内多种生理病理过程,如细胞增殖、分化、凋亡、炎症反应等,可参与调节多种炎性介质的合成,在一定程度上调控了支气管哮喘的炎症反应,支气管哮喘发病的关键〔11〕。AP-1的活化能够接收信号,从而启动基因的转录与炎症蛋白的合成,调节Th2细胞因子如IL-4、IL-5的表达,这是哮喘气道炎症的发生机制之一〔12,13〕。C-Fos作为一种即刻早期基因,在生理状态下即有低水平表达,调控着多种细胞的生长和分化,已证实C-Fos参与了气道炎症反应〔14〕。本研究结果显示,鹿茸大补汤颗粒对哮喘缓解期的治疗有效,其机制可能是通过降低ERK信号通路中AP-1、C-Fos的表达,从而减轻气道炎性反应,抑制气道重塑来实现。

另外,当机体受到过敏原刺激时,IgE交联导致肥大细胞和嗜酸性粒细胞脱颗粒释放白三烯和组胺等炎性介质进而引发哮喘的炎症反应,降低IgE水平,可有效缓解肺组织的炎症程度〔15〕。当机体受异常抗原刺激时,Th1细胞亚群功能低下,显著表现为血清中IFN-γ浓度降低;Th2细胞亚群功能亢进,显著表现为血清中IL-4 浓度升高〔16〕。大量IL-4可促进机体Th0细胞向Th2细胞转变,抑制其向Th1细胞的分化,导致Th2出现优势表达,大量释放IL-5、IL-13,进而释放粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF);IL-5则与 GM-CSF共同作用,激活嗜酸性粒细胞的释放,引发气道炎症,多种途径协同作用,共同诱发哮喘〔17,18〕。研究表明,哮喘缓解期患者仍然存在Th1/Th2亚群失衡,主要表现为外周血IgE、IL-4、IL-5等仍高于正常,而IFN-γ降低〔19~21〕。本研究证实鹿茸大补汤颗粒可有效抑制IgE的合成,降低IL-4、IL-5含量,升高IFN-γ含量。

本文采用豚鼠哮喘缓解期模型,动物在哮喘缓解期内处于主要症状消失、病情基本缓解的哮喘缓解阶段,但在此阶段,气道慢性炎症及炎症导致的气道高反应性和气道重塑等病理特征依然存在。本研究结果可见,鹿茸大补汤颗粒对豚鼠哮喘缓解期的调控作用机制与激活ERK信号转导通路相关,即激活ERK,进而介导AP-1、C-Fos的转录活化,有效抑制IgE的合成,降低IL-4、IL-5含量,升高IFN-γ含量,保持Th1/Th2细胞亚群平衡,对哮喘缓解期病理改变及相关炎症因子有较好的干预作用,有效改善肺内损伤程度。

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