淫羊藿苷联合针灸对深静脉血栓大鼠氧化应激、TXB2/6-Keto-PGF1α及Nrf2/HO-1信号通路的作用

刘静 李玉燕 伊俊豪 武雨侠 邓永健

(新疆阿勒泰地区中医医院(阿勒泰地区哈萨克医医院),新疆 阿勒泰 836500)

深静脉血栓(DVT)是一种静脉回流障碍性疾病,血液在血管内发生凝结后阻塞血管所导致的高发疾病〔1〕。DVT流行病学研究证实,全球每年DVT死亡人数约1 500万人,发病率高达1/1 000,因早期静脉血栓栓子可随着血液循环达到肺部诱发肺部栓塞,具有高死亡率及易漏诊等特点,严重威胁患者生命安全〔2〕。氧化应激是指机体细胞或组织氧自由基升高或清除活性氧自由基(ROS)能力降低而诱发的氧化损伤过程。在病理条件下氧化应激可增加血管内皮功能损伤,主要是通过促进炎症因子激活而加快血管系统障碍而加快DVT形成〔3〕。这与以往学者研究的氧化应激与多种心血管疾病发展密切相关的研究类似〔4〕。核因子-E2相关因子(Nrf)2是氧化应激敏感因子,可被诸多因素如ROS、抗氧化剂等激活进入细胞核,与抗氧化反应元件(ARE)结合,调控体内多种抗氧化酶的表达,从而发挥抗氧化作用〔5〕。血红素加氧酶(HO)-1能够通过降解亚铁血红素生成一氧化碳等产物参与氧化应激损伤等病理生理过程。以往研究证实,在DVT产生时存在血栓素(TX)A2/前列腺素(PG)F1α表达异常,TXA2具有促进血小板聚集和加快血管收缩的作用,PGF1α与之存在相反作用,能够抑制血小板聚集发挥血管扩张作用,在非病理条件下两者处于动态平衡阶段但是在DVT病理条件下两者存在不稳定性,可转化为TXB2和 6-Keto-PGF1α,增加血管斑块聚集从而加重病情〔6〕。

目前对DVT的治疗主要以西药为主,但是西药用药安全性和毒副作用仍处于讨论阶段。中药在治疗DVT具有较大优势和潜力。淫羊藿苷是从淫羊藿总黄酮中提取的有效成分,可在叶淫羊藿、柔毛淫羊藿等干燥茎叶中提取,具有改善脑缺血缺氧、减少心肌梗死及增加抗氧化酶活性的作用〔7〕。针刺是我国传统治疗方式之一,经络与五脏六腑之间关联密切。长期以来,针灸在治疗脑卒中、高血压及糖尿病等方面疗效较好,被认为能够发挥调气利血、温经通络作用〔8〕。但是将淫羊藿苷联合针灸治疗DVT的治疗研究较少,因此本文通过建立DVT大鼠模型观察淫羊藿苷联合针灸的疗效,为DVT临床治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1实验大鼠 SD成年雄性大鼠50只,体质量225～260 g,4～5周龄,在广东省医学SD大鼠中心购买。动物许可证号：SYXK(粤)2017-0026,5只大鼠1个笼子,温度23 ℃左右,湿度要求50%左右,黑夜白昼交替循环,自由进食标准颗粒饲料,饮干净饮用水。所有实验动物于开始实验前,适应环境饲养1 w。动物实验的实施严格遵照《实验动物护理和使用指南》,试验严格遵守国际疼痛学会使用指南,尽可能减少大鼠的使用量、对大鼠的伤害及导致的痛苦。

1.2药物、试剂与仪器 淫羊藿苷〔默克生命科学,高效液相色谱HPLC≥94%,美国化学文摘服务社(CAS)：489-32-7,国药准字：20150311〕;戊巴比妥钠(上海上药新亚,国药准字：31021724,注射用水稀释为2% 溶液);Nrf2单抗、HO-1单抗〔艾比玛特医药科技(上海)〕;苏木素-伊红(HE)试剂盒(上海莼试生物);毫针(苏州神龙针灸医疗,规格：0.30 mm)、华佗牌电针治疗仪(上海医用电子仪器,SDZ-Ⅱ),蛋白电泳仪(北京六一生物 DYCZ-24DH)。

1.3分组及DVT模型建立 大鼠按照随机数字方法分为Sham组、DVT组、药物组、针刺组及联合组,均10只。大鼠均采用0.2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉,保持仰卧位及固定,消毒铺巾,逐层分离腹部皮肤,沿着左下肢股静脉行走切3.5 cm的皮肤,显露且游离左侧股静脉,采用(1-0)结扎近心端股静脉,肉眼可见左下肢肿胀则为建模成功。Sham组不进行结扎,仅做一切口后缝合。

1.4干预方法 建模成功后,药物组灌胃0.1 ml/kg的淫羊藿苷,连续干预3 w,针刺组根据华兴邦制定的实验动物穴位图谱取穴,取足三里、脾俞及膈俞。大鼠固定在自制的操作台上,暴露皮肤后标色定位。采用0.30 mm不锈钢无菌针针刺所选穴位,连接SDZ-Ⅱ行电针治疗仪,采用连续波以局部皮肉轻度颤动为易,留针15 min,每日1次,连续3 w。联合组治疗方法同药物组和针刺组。Sham组和DVT组均灌胃等体积0.9%生理盐水。

1.5酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TXB2及6-Keto-PGF1α水平 干预后大鼠空腹取静脉血1.2 ml,保存在乙二胺四乙酸(EDTA)管,离心机按照3 000 r/min(半径10 cm)分离10 min,离心完成后静置10min,保留上清液保存于-20 ℃冰箱中,采用ELISA检测TXB2及6-Keto-PGF1α水平。

1.6氧化应激指标检测 干预后各组取血同上,保留血清采用黄嘌呤氧化酶法检测各组血清中超氧化物歧化酶(SOD)水平,采用硫代巴比妥酸(TBA)方法检测各组血清中丙二醛(MDA),可见光法分析检测过氧化氢酶(CAT)及比色法方法检测谷胱甘肽过氧化氢酶(GSH-px)水平。

1.7组织提取及HE染色 2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉后,固定于恒温台上,心脏穿刺致死,开腹部剥离左侧下腔静脉血管,Bonic液固定血管石蜡包。10%甲醛溶液中,固定过夜,自来水冲洗,浸泡于14% EDTA溶液中脱钙,逐层脱水后石蜡包埋后4 μm切片后备用。组织切片放入37 ℃复温15 min,二苯甲脱蜡后按照100%～95%～85%及75%乙醇进行逐层脱水,苏木素染色10 min,盐酸(1%)处理,伊红复染,100%～95%～85%及75%乙醇脱水,封片后观察组织形态。

1.8TUNEL法检测各组血管组织内皮细胞凋亡 血管组织与蛋白酶K室温孵育,切片浸入TUNEL反应液中,后磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次。过氧化氢冲洗淬灭酶活性,后联合抗生物蛋白过氧化氢酶和二氨基联苯胺覆盖,光学高倍显微镜下进行观察凋亡细胞核呈现棕黄色,随机选择5个视野下的细胞观察凋亡率。凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.9免疫印迹检测血管组织中Nrf2/HO-1表达 取血管组织50 mg,采用PBS冲洗后切碎,加入1 ml的细胞裂解液,10 000 r/min 4 ℃离心5 min,取上清液,加入样孔中,采用二喹啉甲酸(BCA)法测总蛋白浓度,每孔上样蛋白量20 μg,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。转印缓冲液配制好后放入4 ℃冰箱内预冷,然后全部转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,再把脱脂奶粉加入,全程封闭时长1 h。加入1抗Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶1 000),TBS-吐温2缓冲液(TTBS)漂洗3次,每次10 min;4 ℃过夜,加入羊抗兔IgG二抗(1∶2 500),电化学发光(ECL)试剂系统JY-Clear分析蛋白值。

1.10统计学分析 采用SPSS23.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组血清中TXB2、6-Keto-PGF1α及TXB2/6-Keto-PGF1α水平比较 与Sham组相比,其余4组血清中TXB2、TXB2/6-Keto-PGF1α水平显著升高,6-Keto-PGF1α水平显著降低(P<0.05);与DVT组相比,药物组、联合组及针刺组TXB2、TXB2/6-Keto-PGF1α水平显著降低,6-Keto-PGF1α水平显著升高(P<0.05);与药物组及针刺组相比,联合组血清中TXB2及TXB2/6-Keto-PGF1α水平显著降低,6-Keto-PGF1α水平显著升高(P<0.05),见表1。

表1 各组血清中TXB2、6-Keto-PGF1α、TXB2/6-Keto-PGF1α及SOD、MDA、CAT、GSH-px水平比较

2.2各组血清中氧化应激SOD、MDA、CAT及GSH-px水平比较 与Sham组相比,其余4组血清中MDA显著升高,SOD、CAT及GSH-px水平显著降低(P<0.05);与DVT组相比,药物组、联合组及针刺组血清中MDA显著降低,SOD、CAT及GSH-px水平显著升高(P<0.05);与药物组及针刺组相比,联合组血清中MDA显著降低,SOD、CAT及GSH-px水平显著升高(P<0.05),见表1。

2.3HE染色检测各组静脉血管组织病理改变 Sham组下腔静脉管腔无明显扩张,血管腔内无实质性血栓形成,血管静脉结构及内膜完整,未见坏死内皮细胞;DVT组下腔静脉内可见大量血栓形成,颜色呈现暗红色,血管壁组织疏松、水肿及内膜呈现不规则的同时存在大量炎症细胞浸润。药物组及针刺组炎症细胞减少,血栓减少但血管内膜呈现不规则;联合组静脉管腔出现扩张,管腔内血栓减少及未见炎症细胞浸润。见图1。

图1 各组静脉血管组织病理改变(HE染色,×200)

2.4TUNEL法检测各组血管内皮细胞凋亡率比较 与Sham组〔(3.14±0.23)%〕相比,DVT组内皮细胞凋亡率〔(14.25±2.55)%〕显著升高(P<0.05);与DVT组相比,药物组及针刺组内皮细胞凋亡率〔分别为(9.25±1.44)%、(8.69±1.50)%〕显著降低(P<0.05);与药物组及针刺组相比,联合组内皮细胞凋亡率〔(6.85±1.24)%〕显著降低(P<0.05),见图2。

2.5免疫印迹检测各组血管组织中Nrf2、HO-1蛋白水平 与Sham组相比,其余4组血管组织中Nrf2、HO-1蛋白表达显著降低(P<0.05);与DVT组相比,药物组、联合组及针刺组血管组织中Nrf2、HO-1蛋白表达显著升高(P<0.05);与药物组及针刺组相比,联合组血管组织中Nrf2、HO-1蛋白表达显著升高(P<0.05),见表2、图3。

表2 各组血管组织中Nrf2、HO-1蛋白水平

3 讨 论

DVT疾病常发生在髋关节及膝关节置换术后并常伴随脊髓损伤,发生率高达80%～100%,且5%的患者合并肺栓塞。DVT形成早期常导致静脉血栓脱落,其可随血液循环而达到肺部诱发肺栓塞,升高患者死亡率。DVT疾病形成与机体氧化应激反应存在相关性,DVT发生早期机体存在炎症损伤,可生存大量ROS,打破了机体氧化-抗氧化平衡,导致血液中存在大量ROS,形成内皮细胞氧化应激损伤而增加内皮细胞凋亡。本研究表示,DVT大鼠氧化应激损伤加剧,通过灌胃淫羊藿苷联合针刺能够通过抑制氧化应激而改善内皮细胞凋亡,减少血管内皮损伤,并通过上调血管组织中Nrf2/HO-1活性而发挥作用。

DVT的发生机制与血流缓慢及血管内膜损伤相关,血管内膜损伤可导相关因子异常,共同促进疾病发生发展。前列环素(PGI)2是主要产生于血管内皮细胞并能够具有抑制血小板聚集抑制血栓形成的因子。TXA2是一种主要由血小板分泌,存在血管收缩及聚集作用因子。在正常生理环境下上述两种因子可保持动态平衡以维持凝血功能正常,但当上述指标出现极不稳定时能够转化成稳定的TXA2/6-Keto-PGF1α而加重血管损伤〔9〕。在中医学中DVT可归为“脉痹”或肿胀范畴,根据现在中医诊疗规范将其统一称之为“股肿”,认为其发生机制与瘀、湿及热相关,临床治疗以益气活血化瘀为治疗根本〔10〕。清代唐宗海《血论证·吐血》中认为淤血不去,新血不生,认为活血化瘀是治疗总原则。淫羊藿苷属于小檗科淫羊藿植物叶中提取的总黄酮的主要活血成分,现代药理认为其具有增加免疫功能、改善心脑血管功能及调节内分泌等作用〔11〕。淫羊藿在《本草纲目》中被称为具有“益糟气,坚筋骨,补腰膝,强心力”之功效。现代理论认为其能够通过增加血管内皮血流量,改善微循环而减少组织缺氧缺血,发挥血管保护作用〔12〕。DVT疾病血瘀为标本,针刺百会穴能够振奋周身阳气达到舒筋通络而健脑补髓发挥调和气血等功能,而有利于减少血瘀,发挥减少血栓的作用。周宇博等〔13〕研究表示,采用针刺风池穴、百会穴及双侧风池穴能发挥祛除血瘀而改善脑血管血瘀的作用。本研究说明,淫羊藿苷联合针刺能够通过抑制TXA2/6-Keto-PGF1α表达而抑制血管血栓形成。

氧化应激是广泛存在于生物体内,受到刺激产生的一种防御反应。在创伤、炎症反应等病理条件下,其氧化应激反应增强的同时导致大量氧化应激因子水平异常,加快血管内皮细胞损伤及凋亡〔14〕。SOD水平升高表示机体总抗氧化能力减弱。SOD属于一种细胞自由基清除剂,具有促进超氧阴离子发生歧化反应的作用,同时可抑制MDA等氧化因子的表达,具有内皮细胞修复和稳定的作用。DVT发生后可存在大量ROS及羟自由基生成,CAT及GSH-ps降低,MDA表达升高是脂质过氧化物的终产物,能够参与机体氧化系统失衡,较好反应血管内皮过氧化损伤程度〔15〕。以往研究证实,淫羊藿苷能够较好改善微血管心肌缺血,还能通过改善血管氧化应激而增加内皮细胞活性〔16〕。淫羊藿苷是淫羊蕾的主要成分,属于补肾温阳药物,具有抗氧化应激损伤及保护内皮细胞的作用。胡彦武〔17〕研究表示,淫羊藿苷能够减少半胱氨酸(Hcy)诱导的血管损伤,主要通过抑制MDA表达、增加SOD水平,进一步减少血管内皮细胞凋亡而发挥抗血栓作用。针刺具有抗氧化应激、调节自由基而发挥抑制细胞凋亡的作用。针刺的抗氧化作用通过调节体内自由基动态平衡,从而发挥抑制内皮细胞损伤等作用。在卵巢细胞中,磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)是细胞活性调节因子,针刺能够调节信号通路,调节细胞凋亡机制。本研究说明,淫羊藿苷联合针刺可通过抑制氧化损伤而改善血管内皮细胞凋亡。

在氧化应激反应过程中Nrf2/HO-1活性失活,其表达升高后能够抑制由糖代谢异常导致的氧化损伤,DVT发生过程中炎症因子被激活可促进巨噬细胞活性并聚集,进而形成斑块阻塞血管〔18〕。在DVT小鼠模型中激活Nrf2可增加下游Ⅱ相酶表达,减少低密度脂蛋白介导的巨噬细胞聚集,减少血管内泡沫细胞形成,减少血栓形成。HO-1是Nrf2信号的下游靶基因,两者结合后能够抑制DVT中斑块形成,结合以往研究证实抑制血管氧化损伤能够上调Nrf2/HO-1表达并与减少血管损伤相关〔19〕。淫羊藿苷可通过激活Nrf2水平而发挥抗氧化作用,能够减少炎症反应而发挥血管保护作用。针灸具有调节微循环而发挥抗炎及抗氧化应激功能,其被认为在创伤性脑出血大鼠中能够通过抗氧化作用激活Nrf2/HO-1表达,而发挥脑血管保护作用。陈明霞等〔20〕研究表示,淫羊藿苷剂量依赖性地通过激活Nrf2/HO-1/醌氧化还原酶(NQO)1信号通路改善缺血再灌注引起的大鼠肾损伤。潘亮等〔21〕研究表示,银杏达莫联合针灸通过上调Nrf2/HO-1通路活性改善大鼠创伤性脑出血后神经功能,这与抑制氧化应激损伤相关。本研究结果表明,淫羊藿苷联合针刺可激活Nrf2/HO-1抗氧化损伤,发挥血管保护作用。

综上,淫羊藿苷联合针灸能够通过抑制TXB2/6-Keto-PGF1α及氧化应激水平改善血管内皮损伤,与激活Nrf2/HO-1信号通路相关。本文仍存在一定不足之外,未进行细胞有关试验及样本量较少,实验内容单一,今后应扩大样本量充实实验内容,为相关研究提供有利依据。