基于HIF-1α/VEGF信号通路探讨Ilizarov技术治疗糖尿病足溃疡的机制

柏小金 徐林 刘福英 艾敏 黄文良

(遵义医科大学第三附属医院 遵义市第一人民医院骨科,贵州 遵义 563000)

糖尿病足是糖尿病性肢端坏疽,是通过神经病变感染、糖尿病外周血管病变等引起下肢或足损伤的一类病变〔1〕。有研究发现〔2,3〕,出现坏疽或足溃疡的糖尿病患者占比≥15%。血管基底膜加厚、血液高黏滞综合征、内皮受损、微循环异常等为造成糖尿病足的重要病理特征,而低氧诱导因子(HIF)-1α在缺氧的环境下可对血管内皮生长因子(VEGF)转录予以调控以控制VEGF的表达水平;VEGF为促血管生成的重要因子,可有效促使血管的修复与生成,改善体内微循环,促进糖尿病足溃疡愈合〔4,5〕。血管腔内介入、血管移植术等下肢血供重建手段为临床诊治糖尿病足溃疡较为常用的方法,但无法改善微循环。基于再生骨组织前先新生血管网络的原理,临床对下肢慢性缺血性病通过伊里扎洛夫(Ilizarov)技术进行治疗,效果显著〔6,7〕。基于此,本文探究Ilizarov技术治疗糖尿病足溃疡及对创面组织中HIF-1α/VEGF信号通路的调节效果。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取SPF级的大鼠35只,7～8周龄,体质量200～255 g,平均为(230.38±15.10)g,大鼠许可证号：SYXK(川)2021-246,大鼠饲养环境：55%～70%湿度,22～27 ℃温度,且在标准鼠笼中喂养,光照24 h,明暗循环12 h。适应性饲养1 w后开始试验。本试验均严格按动物实验标准予以操作,且取得遵义市第一人民医院伦理委员会批准。

1.2建模与分组 大鼠适应性饲养1 w后,参照于泽洋等〔8〕方法建模。随机选10只大鼠为对照组并喂普通饲料,剩余25只用高糖高脂的饲料进行喂养,喂养4 w后,对照组一次性腹腔输注柠檬酸钠缓冲液(0.1 mol/L),剩余的25只大鼠一次性腹腔注入60 mg/kg 链脲佐菌素〔STZ,在pH4.5的柠檬酸钠缓冲液(0.1 mol/L)内溶解〕,72 h后对血糖水平进行测定,空腹下血糖水平超过16.5 mmol/L的大鼠视为糖尿病模型大鼠,最终有20只大鼠完成建模。经腹腔输注4% 水合氯醛麻醉大鼠,在无菌的条件下通过5 mm的皮肤活检打孔器于大鼠的背侧后足建立单个圆形全程皮肤溃疡创面伤口,以完成建模,即为糖尿病足溃疡模型大鼠。将建模完成的20只大鼠随机分成模型组与Ilizarov技术组,每组10只。对照组与模型组灌胃生理盐水6 ml/kg,每天灌胃1次,连续干预4 w。

1.3Ilizarov技术干预 首先在术前控制饮食的基础上,皮下输注胰岛素进行血糖控制,尽量使空腹血糖<8.0 mmoI/L,按创面分泌物监测培养细胞的结果,选取有效的抗生素,且在治疗后按培养与药敏的结果调节使用抗生素的方法,大鼠均施以活血化瘀以改善机体微循环、神经代谢及营养治疗等。术中先进行全身麻醉或硬膜外麻醉,不使用止血带,在患病肢体的胫骨内前方的中下段画出截骨的范围,长度约占胫骨长度1/4,长20 mm,宽10 mm,先在截骨的部位施以3个纵向约10 mm的切口,选取闭合截骨器(1.5 mm)在胫骨的内侧嵴处切口约10 mm×5 mm大小的胫骨骨窗,于骨块处钻有2个1.5 mm直径的孔,放置2根横拉牵引针,且平行于牵引针,在胫骨的上下端平行钻进4根2.0 mm直径的固定针,后使用薄骨刀将骨皮质切透,装置横向的骨搬移仪器。固定安装各个固定钉与提位钉,切口缝合、消毒、包扎,完成手术。

1.4创面愈合率及创面平均愈合时长检测 分别于成功建模与Ilizarov技术干预后对创面予以拍摄,且经 ImageJ 软件检测创面面积,通过公式分析创面的愈合状况：创面愈合率=(完成建模后创面的面积-干预治疗后的创面面积)/建模完成后的创面面积×100%。对各组大鼠创面完全愈合的时间进行统计分析,算出各组大鼠创面的平均愈合时间。

1.5血清炎症因子检测 在Ilizarov技术干预后抽取腹部血3 ml,以离心转速3 000 r/min、半径5 cm、10 min,分离上清,-60 ℃冰箱中保存,待检。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对各组白细胞介素(IL)-6、C-反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子(TNF)-α进行检测。ELISA试剂盒分别由武汉菲恩生物科技有限公司提供。

1.6病理组织学观察 腹腔输注4%水合氯醛麻醉大鼠,且将其断颈处死,分别取各组大鼠的足溃疡创面组织,制成样本,于-70 ℃冰箱储存,备用。取部分组织置于10%多聚甲醛溶液内进行固定,24 h后取出,进行脱水、脱蜡、切片等处理,用苏木素-伊红染色(HE),监测各组足溃疡创面的病理状况。

1.7创面组织中HIF-1α、VEGF mRNA水平检测 取冰冻创面组织,冰上溶解15 min,采取Trizol试剂对组织内总RNA予以提取,选用PrimeScriptRTMaster Mix 试剂盒用逆转录程序对cDNA进行合成,通过实时荧光定量法检测HIF-1α、VEGF mRNA水平,采用Primer5.0软件设计引物序列,开启PCR仪,引物序列：HIF-1α正向：5′-CTGTGCATGCACAGAAGTGTGTGCTA-3′,HIF-1α反向：5′-TGTGACTGACTTGCGCTCGACTGTAG-3′;VEGF正向：5′-TGTGACTGACTTGCTGTGTGTCGTA-3′,VEGF反向：5′-GTACTACCTGGCTCTGTGTGCGCGT-3′。β-actin正向：5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′,反向：5′-CAGGGG CCATGCTAATCTT-3′。PCR扩增的条件：95 ℃ 1 min,后行45个70 ℃ 10 s及60 ℃ 20 s的循环,并采取2-△△Ct方法计算HIF-1α、VEGF mRNA水平表达,β-actin作内参。

1.8HIF-1α/VEGF信号通路蛋白相对表达量检测 应用Western印迹法检测各组大鼠创面组织中的HIF-1α、VEGF水平,取各组大鼠冷冻组织,冰上溶解15 min,以比例100 mg：1 ml放等量体积的蛋白液内行裂解反应,于5 ℃静置5 min,将各组的样本放于离心机中,分离清液,使用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白液体的含量,试剂盒由天根生化科技(北京)有限公司(货号：PA115-01)提供,计算样本值,后将50 μg 蛋白样本行凝胶电泳分离1.0～1.5 h,后将凝胶中的蛋白标本放置聚偏氟乙烯(PVDF)膜上2 h,加HIF-1α、VEGF抗体为一抗,按1∶1 000比例予以稀释,维持5 ℃过夜,Tris-HCl缓冲盐溶液(TBST)清洗膜3～5次,次日加入辣根过氧化物酶(HRP)标记作二抗,室温培养1 h,加显色剂,放于光镜下,行显色、显影、定形约2 min,获取数值,试验重复3次。内参为GAPDH。

1.9统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行χ2检验、t检验、配对t检验、F检验。

2 结 果

2.1病理组织学观察 如图1所示,对照组皮肤组织表皮构造清晰完整,细胞整齐排列且紧密,胞质均匀、红染,细胞核的形态正常;模型组创面组织复层扁平的上皮层显著增厚,细胞核崩解固缩,表皮层的细胞发生坏死,坏死的区域呈现较多的炎性细胞浸润,真皮层大量胶原纤维坏死;Ilizarov技术组真皮层胶原纤维的坏死区域可呈现纤维细胞的增生与淋巴细胞浸润,有生成新的毛细血管,皮下肌层能清楚显示,细胞核的形态正常,与模型组相比,病理损伤显著改善。

图1 各组皮肤组织学观察(HE染色,×400)

2.2各组治疗后创面愈合率及创面平均愈合时长对比 如表1所示,与对照组比较,模型组、Ilizarov技术组的创面平均愈合时长增加,创面愈合率下降,具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,Ilizarov技术组的创面平均愈合时长降低,创面愈合率升高,具有统计学差异(P<0.05)。

表1 各组治疗后创面愈合率及创面平均愈合时长、血清炎症因子、创面组织中HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白水平对比

2.3各组血清炎症因子表达对比 如表1所示,与对照组对比,模型组、Ilizarov技术组IL-6、CRP、TNF-α表达升高,具有统计学差异(P<0.05);与模型组对比,Ilizarov技术组的IL-6、CRP、TNF-α表达下降,具有统计学差异(P<0.05)。

2.4各组创面组织中HIF-1α、VEGF mRNA及蛋白水平对比 如表1、图2所示,与对照组对比,模型组、Ilizarov技术组创面组织中HIF-1α、VEGF mRNA及蛋白表达降低,具有统计学差异(P<0.05);与模型组对比,Ilizarov技术组创面组织中HIF-1α、VEGF mRNA及蛋白表达升高,具有统计学差异(P<0.05)。

图2 Western印迹检测各组HIF-1α/VEGF信号通路蛋白

3 讨 论

糖尿病足溃疡的中位愈合时长约12 w,与截肢的风险密切相关〔9,10〕。部分的新生血管生成下降及外周血流下降为造成糖尿病患者伤口难以愈合的主要因素,又因营养物质及氧气的转移能力较差,较多的微血管疾病会延缓胶原蛋白生成、细胞浸润、肉芽组织生成等〔11,12〕。

修复或重建糖尿病足溃疡功能异常的血管为治疗糖尿病足溃疡的重点,而Ilizarov技术在进行胫骨横向骨搬移时,因持续性进行牵引可有效促进细胞增殖与生物合成,骨窗周围有较丰富的血管网出现,进而促使下肢微循环再生血管或加快周围神经的改善及改善下肢血管的侧支微循,以有效治疗糖尿病足溃疡引起的缺血闭塞〔13,14〕。研究显示〔15〕,术后胫骨横向骨搬移方法可有效改善糖尿病足溃疡的创面愈合状况,以更好地促使患肢血管及神经的再生,建立缺血肢体的侧支微循环。本文研究发现,通过Ilizarov技术治疗糖尿病足溃疡可有效加快创面的修复,减缓IL-6、TNF-α、CRP水平,加快病情改善,与其他学者研究相似〔16,17〕。本文表明,糖尿病足溃疡患者通过接受Ilizarov技术进行治疗效果较佳,可更好地促进创面愈合,降低炎症因子水平。

研究表示〔18,19〕,新生血管生成损伤的潜在机制为诱导缺氧的VEGF水平下降,这是因HIF-1α的反向激活所导致的。这种变化是通过高糖暴露下降了HIF-1α与其共激活因子p300进行结合,活性氧簇(ROS)对甲基乙二醛进行诱导对p300予以修饰而造成,而高血糖经干扰HIF-1α的平稳性,进而减缓HIF-1α及其下游基因的VEGF水平〔20〕。因此,HIF-1α/VEGF信号通路功能损伤可作为是糖尿病足溃疡患者血管形成损害及伤口延迟愈合的重要原因。本研究显示,通过Ilizarov技术治疗糖尿病足溃疡可有效对HIF-1α/VEGF信号通路的表达水平进行调节,以改善病情,在糖尿病足溃疡中HIF-1α、VEGF水平呈低表达,经治疗后HIF-1α、VEGF水平能有效进行缓和,与其他学者研究较一致〔21,22〕。HIF-1α/VEGF信号通路可作为Ilizarov技术治疗糖尿病足溃疡疾病的主要靶点,提升创面愈合效果,缓减炎症反应。综上所述,使用Ilizarov技术可对糖尿病足溃疡症状进行干预,疗效明显,以发挥出缓和创面坏死组织,提高创面愈合率,降低炎症因子水平的作用,改善病情,其作用机制可能与调节HIF-1α/VEGF信号通路蛋白的表达有密切的联系。