LncRNA MIAT靶向miR-361-3p影响内毒素诱导的血管内皮细胞氧化应激损伤的分子机制

张一铭 王国华 孙一峰

(绍兴市人民医院血管疝外科,浙江 绍兴 312000)

脓毒症是一种高发病率,高病死率的疾病,其多累及血管内皮,血管内皮细胞在调节血管功能,生理和病理生理过程中起着至关重要的作用,其内皮细胞功能障碍或损伤是脓毒症发生发展的核心环节,脓毒症发生时,相关毒素可引发氧化应激反应,从而使血管内皮细胞发生损伤,最终导致脓毒症患者各器官发生障碍〔1～3〕。内毒素(LPS)是革兰阴性菌细胞壁的主要结构成分,可直接损伤血管内皮细胞〔4〕。研究表明,长链非编码RNA(LncRNA)参与调控内皮细胞的损伤过程〔5〕。心肌梗死相关转录本(MIAT)是一种与心血管疾病相关的LncRNA,研究报道急性冠脉综合征患者外周血清中LncRNA MIAT表达水平显著增高,是急性冠脉综合征相关危险因素,其可能参与血管内皮的炎症反应〔6〕。敲低LncRNA MIAT通过在动脉粥样硬化过程中调节miR-214-3p/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-1信号传导来减轻内皮细胞损伤〔7〕。敲低LncRNA MIAT通过调控miR-330-5p/肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)6/核因子(NF)-κB 轴抑制LPS诱导的败血性心肌病炎症和氧化应激〔8〕。研究报道,敲低肺腺癌转移相关转录本(MALAT)1通过调节miR-361-3p/SOCS3轴抑制高糖诱导的血管内皮细胞炎症和凋亡〔9〕。说明LncRNA MIAT和miR-361-3p均参与调控血管内皮细胞的凋亡和严重炎症损伤,但其对氧化应激损伤的影响尚未可知。本实验旨在研究LncRNA MIAT通过调控miR-361-3p对内毒素诱导的血管内皮细胞氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1细胞与主要试剂 人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs,上海冠导生物工程有限公司);DMEM培养基、LPS(美国Sigma公司);Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒(大连宝生物);蛋白提取试剂盒、凋亡检测试剂盒(上海贝博生物);丙二醛(MDA)含量检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒(南京建成生物);双荧光素酶报告基因检测试剂盒(上海碧云天生物)。

1.2细胞处理与分组 HUVECs常规培养于DMEM培养基中,用0.1 μg/ml的LPS处理细胞,记为LPS组,正常培养细胞作为对照(control)组;将LncRNA MIAT干扰表达载体及阴性对照、miR-361-3p模拟物及阴性对照转染至HUVECs后用0.1 μg/ml的LPS处理,记为si-LncRNA MIAT+LPS组、si-NC+LPS组、miR-361-3p+LPS组、miR-NC+LPS组;将miR-361-3p抑制剂及阴性对照分别与LncRNA MIAT干扰表达载体共转染至HUVECs后用0.1 μg/ml的LPS处理,记为anti-miR-361-3p+si-LncRNA MIAT+LPS组、anti-miR-NC+si-LncRNA MIAT+LPS组。

1.3实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测LncRNA MIAT和miR-361-3p的表达水平 提取各组细胞总RNA,并检测RNA浓度,反转录成cDNA,用荧光定量试剂盒进行PCR扩增。以GAPDH和U6为内参,LncRNA MIAT和miR-361-3p表达水平用2-△△Ct法计算。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞培养48 h后,用预冷PBS漂洗2次细胞,加500 μl的结合缓冲液后,先加10 μl膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ-FITC),再加5 μl PI,避光孵育10 min;上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5Western印迹法检测蛋白表达 提取各组细胞总蛋白,然后在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)处理蛋白样品,转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,加入Cleaved-caspase-3、β-actin抗体4 ℃孵育过夜,室温加入二抗孵育2 h,显影、定影。使用软件并分析蛋白条带灰度值。

1.6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测MDA含量和SOD、CAT活性 细胞培养48 h后收集各组细胞上清液,按试剂盒说明书进行操作检测MDA含量、SOD活性、CAT活性。

1.7双荧光素酶报告实验 构建含有miR-361-3p结合位点的 LncRNA MIAT野生型(WT)及突变型(MUT)报告基因载体,并分别与miR-361-3p或miR-NC共转染至血管内皮细胞,转染48 h后按照说明书检测荧光素酶活性。

1.8统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验,方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1LPS诱导血管内皮细胞后LncRNA MIAT和miR-361-3p的表达情况 与control组比较,LPS组血管内皮细胞中LncRNA MIAT表达水平明显升高,miR-361-3p表达水平明显降低(P<0.001),见表1。

表1 LPS处理的血管内皮细胞中LncRNA MIAT和miR-361-3p的表达情况

2.2低表达LncRNA MIAT对LPS处理的血管内皮细胞氧化应激损伤的影响 与control组比较,LPS组LncRNA MIAT、Cleaved-caspase-3表达水平、细胞凋亡率、MDA含量明显升高,SOD和CAT活性明显降低(P<0.05);与si-NC+LPS组比较,si-LncRNA MIAT+LPS组LncRNA MIAT、Cleaved-caspase-3表达水平、细胞凋亡率、MDA含量明显降低,SOD和CAT活性明显升高(P<0.05),见图1、图2、表2。

1～4：control组,LPS组,si-NC+LPS组,si-LncRNA MIAT+LPS组图1 低表达LncRNA MIAT对LPS处理的血管内皮细胞相关蛋白表达的影响

图2 低表达LncRNA MIAT对LPS处理的血管内皮细胞凋亡的影响

表2 低表达LncRNA MIAT对LPS处理的血管内皮细胞氧化应激损伤的影响

2.3miR-361-3p高表达对LPS诱导的血管内皮细胞氧化应激损伤的影响 与miR-NC+LPS组比较,miR-361-3p+LPS组Cleaved-caspase-3表达、细胞凋亡率、MDA含量明显降低,miR-361-3p表达、SOD活性和CAT活性明显升高(均P<0.05),见表3、图3。

1～4：miR-NC+LPS组,miR-361-3p+LPS组,anti-miR-NC+si-LncRNA MIAT+LPS组,anti-miR-361-3p+si-LncRNA MIAT+LPS组图3 高表达miR-361-3p对LPS处理的血管内皮细胞凋亡和相关蛋白表达的影响

表3 高表达miR-361-3p对LPS处理的血管内皮细胞增殖和凋亡的影响

2.4LncRNA MIAT靶向调控miR-361-3p的表达 Starbase预测显示LncRNA MIAT和miR-361-3p有结合位点(图4)。miR-361-3p与LncRNA MIAT WT报告质粒共转染后血管内皮细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)(表4)。与si-NC组比较,si-LncRNA MIAT组LncRNA MIAT表达水平明显降低,miR-361-3p表达水平明显升高(P<0.05);与pcDNA-NC组比较,pcDNA-LncRNA MIAT组LncRNA MIAT表达水平明显升高,miR-361-3p表达水平明显降低(P<0.05),见表5。

图4 starbase对LncRNA MIAT和miR-361-3p结合进行预测示意图

表4 双荧光素酶报告实验

表5 qRT-PCR检测LncRNA MIAT和miR-361-3p的表达

2.5miR-361-3p低表达可以部分回复LncRNA MIAT低表达对LPS处理的血管内皮细胞氧化应激损伤的影响 与anti-miR-NC+si-LncRNA MIAT+LPS组比较,anti-miR-361-3p+si-LncRNA MIAT+LPS组miR-361-3p表达水平、SOD和CAT活性明显降低,Cleaved-caspase-3表达水平、细胞凋亡率、MDA含量明显升高(均P<0.05),见表6、图5。

表6 低表达miR-361-3p可以逆转LncRNA MIAT低表达对LPS处理的血管内皮细胞氧化应激损伤的影响

3 讨 论

脓毒症是指宿主对感染引起的危及生命的器官功能失调,内皮功能障碍对脓毒症的发生发展起重要作用,而氧化应激会改变多种内皮细胞功能,与内皮细胞损伤相关的分子可以作为脓毒症早期诊断和预后指标,为脓毒症诊断治疗提供新的思路〔10,11〕。研究报道LncRNA MIAT通过靶向miR-29a-5p促进缺氧诱导的人肺动脉内皮细胞的氧化应激,从而加剧肺动脉高压的发展〔12〕。含有lncRNA MIAT的血清细胞外囊泡可促进诱导心房纤维化、炎症和氧化应激〔13〕。沉默LncRNA MIAT通过调节miR-147a/核因子-κB刺激活蛋白(NKAP)/NF-κB轴减轻了LPS诱导的肺上皮TC-1细胞炎症反应和细胞凋亡〔14〕。抑制LncRNA MIAT可通过调节miR-204-5p/HMGB1轴减轻脑缺血后脑微血管内皮细胞损伤〔15〕。本研究结果表明,低表达LncRNA MIAT可抑制LPS诱导的血管内皮细胞凋亡和氧化应激。

研究报道,敲低lncRNA SNHG1通过通过海绵状miR-361-3p调节ZNF217来减轻Aβ诱导的神经元细胞损伤〔16〕。本研究结果表明,过表达miR-361-3p可减轻LPS诱导的血管内皮细胞损伤。本实验还证实了LncRNA MIAT靶向调控miR-361-3p;而低表达miR-361-3p可以逆转LncRNA MIAT低表达对LPS处理的血管内皮细胞氧化应激损伤的影响。