健脾五穴点按法对老年功能性便秘大鼠的影响

史勇 李成浩 张红石

(1长春大学特殊教育学院,吉林 长春 130022;2长春中医药大学护理学院)

功能性便秘(FC)是指无代谢功能障碍、无结构异常变化、无器质性病因,出现的以排便次数减少、大便干结、排便无力为主要症状的临床病症〔1〕。属于中医学“便秘”“脾约”范畴,是社区生活中较为常见的功能性疾病〔2〕。流行病学显示,我国成年人FC的发病率为4%～6%,年龄越大,发病率越高〔3〕。长期便秘会引起腹胀、食欲下降、口内异味等症状,便秘产生的有害物质亦会增加患者并发胃肠道疾病的风险〔4〕。健脾五穴点按法治疗老年FC,有着较好的临床疗效,但作用机制不明。因此,本研究主要是立足于对健脾五穴的实验机制研究,围绕“脑-肠轴”调节FC的关键作用,探讨健脾五穴点按法治疗老年FC的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级,Wistar大鼠40只,雌雄各半,9月龄,体质量300～350 g,购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司〔许可证号码：SCXK(吉)-2020-0002〕。适应性喂养1 w,雌雄分笼,每笼5只,摄食饮水不限,自然照明,保持环境温度22～24 ℃,湿度55%～60%。

1.2药品及试剂 莫沙必利片,5 mg/片,国药准字J20110022。复方地芬诺酯片(康普),2.5 mg/片,国药准字H32022716。大鼠5-羟色胺(HT)、人血管活性肠肽(VIP)酶联免疫试剂盒(96T;组织匀浆;上海茁彩生物科技有限公司,ZC35959J,ZC37398)。总RNA提取试剂(ml095476)、HG TaqMan miRNA反转录试剂盒(ml095527)、DNA Marker 2000(ml095609)、P物质(SP)兔抗多克隆抗体(ml091754)、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)兔抗单克隆抗体(ml091933)均购自上海酶联生物科技有限公司;β-actin鼠抗单克隆抗体(北京安诺伦生物科技有限公司,YM3029);阿拉伯树胶粉(天津市光复精细化工研究所);异氟烷(上海玉研科学仪器有限公司);98%氯苯丙氨酸(PCPA,上海麦克林生化科技股份有限公司)。

1.3仪器设备 气麻仪(上海玉研科学仪器有限公司,MR7654);9 cm鍉针(宸之瑞办公专营店);酶标仪(BIOTEK,ELX-800);电泳仪(DYY-7C)、转移槽(DYCZ-40D)、水平摇床(WD-9405B)均购自北京六一生物科技有限公司;实时荧光定量-聚合酶链反应(PCR)仪(Applied Biosystems,ABI7500)、超速冷冻离心机(湖南湘仪,H-2050R);电热恒温培养箱(天津泰斯特;DH36001B);离心机(益世科生物科技有限公司,MCR-88-8)。

1.4动物分组及造模 40只Wistar大鼠,喂养7 d后,分为雌雄两笼,每笼20只,按体质量随机分为空白组、模型组、穴位按压组、阳性药物组,每组10只,雌雄分笼各半。空白组给予2%蔗糖灌胃,其余各组采用复方地芬诺脂混悬液建立FC大鼠模型,将复方地芬诺酯片溶解稀释后按大鼠10 mg/kg灌胃,每天1次,连续14 d,当大鼠出现首粒黑便排出时间延长时,为FC模型造模成功。

1.5实验动物干预及取材 空白组、模型组：每日正常饮食饮水,不做干预治疗。穴位按压组：采用9 cm鍉针进行健脾五穴按压治疗,大鼠治疗前采用气麻仪固定在鼠板上,以鍉针垂直在大鼠神阙、中脘、章门(左右)、天枢(左右)和气海进行点按,力度以鍉针自身重力为最大值,每日1次,连续治疗7 d。大鼠穴位定位参照文献〔5〕。阳性药物组：将莫沙必利溶解稀释后按人鼠比例1∶30进行等效剂量换算灌胃(每100 g大鼠给予25 mg药物),每日1次,连续7 d。干预结束后,禁食24 h。麻醉成功后,经腹主动脉采血5 ml,从降结肠与乙状结肠交界处向上取50 mm×3 mm×3 mm肠组织,分别存于-80 ℃冰箱冻存备用。

1.6首粒黑便时间及粪便含水率检测 分别于造模14 d及治疗7 d清晨给水30 min后,给予10 ml/kg的墨汁灌胃,记录每只大鼠墨汁灌胃时间及各组大鼠的首粒黑便排出时间。粪便含水率(%)=(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重×100%。

1.7血清酶联免疫吸附试验(ELISA) 检测大鼠血清5-HT和VIP的含量。按ELISA试剂盒说明测定各组大鼠血清5-HT和VIP的含量。建立标准曲线的直线回归方程式,计算出每个样品5-HT和VIP 的含量。

1.8结肠组织PCR检测 将结肠组织置于离心管中,加入 TRNzol总RNA提取试剂进行总RNA提取,采用分光光度计测定样品浓度和纯度,逆转录合成cDNA,随后进行PCR。SP：上游引物5′-GCATTGCCTCCTTGATTTGG-3′,下游5′-TGGCGGTC-TTTTT TCTCGTT-3′,81 bp;CRF：上游引物5′-TCTCTGGATCTCACCTTCCACCTT-3′,下游5′-AGTTTCCTGTTGCTGTGAGCTTGC-3′,92 bp;(引物由美国 Invitrogen 生物技术有限公司合成,以 GAPDH为内参),数据采用RQ=2-ΔΔCt法计算相对表达量。

1.9Western印迹 检测结肠组织中SP、CRF蛋白表达。采用二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白定量,完成蛋白提取、定量、电泳、转印、封闭、抗体孵育、底物发光等,完成胶片扫描,采用图像处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析目标条带及光密度值。蛋白的相对含量以目的蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值表示。

1.10统计学方法 采用SPSS19.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组治疗7 d后首粒黑便排出时间及粪便含水率比较 治疗7 d后,各组首粒黑便排出时间比较：模型组>穴位按压组>阳性药物组(均P<0.05);模型组粪便含水率明显低于穴位按压组、阳性药物组(均P<0.05),穴位按压组和阳性药物组粪便含水率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组治疗7 d后首粒黑便排出时间、粪便含水率、血清5-HT、VIP和SP、CRF mRNA及蛋白水平比较

2.2ELISA检测各组5-HT、VIP水平 模型组5-HT明显低于穴位按压组、阳性药物组,模型组VIP水平明显高于穴位按压组、阳性药物组(均P<0.05),穴位按压组和阳性药物组5-HT、VIP水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3PCR检测各组结肠组织SP、CRF mRNA和蛋白水平 模型组SP、CRF mRNA和蛋白水平明显低于穴位按压组、阳性药物组(均P<0.05),穴位按压组和阳性药物组SP、CRF mRNA和蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1和图1。

图1 Western印迹检测各组结肠组织SP、CRF蛋白表达

3 讨 论

FC是消化系统常见的功能性胃肠道疾病,发病机制尚未完全明确。西药治疗主要以刺激性泻药为主,效果欠佳,容易反复,长期便秘发作甚至会诱发心脑疾病〔6〕。中医治疗疗效确切持久、治病求本、历史悠久,副作用少,有独特的优势,中医学家认为FC的病因病机主要从脾胃论治,常兼其他脏腑病变〔7〕。治疗方法有中药方剂内服施治、中医外治两类。中药根据临床症状、舌脉表现,四诊合参进行辨证分型施治,效果显著。外治方法多样化,以针灸治疗、穴位贴敷、穴位注射、推拿疗法、中药灌肠为主,疗效显著〔8〕。健脾五穴,是中医腹部按摩常用的推拿选穴。选穴包括神阙、中脘、章门、天枢、气海。神阙是骆竞洪九宫腹部推拿中的中宫,善于运气健脾,调畅气机;中脘、章门,一脏会一腹会,是脏腑点穴中两个合用穴;气海有提气健脾之法,临床效果颇为明显;天枢为天地交接之处、气机转输之纽,点按此穴有利于助气海,运气下行。健脾五穴点按法治疗老年FC临床疗效较好,但因缺少有效的机制支撑,故阻碍了有效的临床推广及应用。近年来研究发现,“脑-肠轴”调节失衡在FC发病过程中扮演了重要的角色,该学说正逐渐成为FC机制研究的新热点〔9〕。相关研究表明,5-HT、VIP、SP、CRF等脑肠肽的表达差异可影响患者的胃肠排空功能和肠蠕动,并与FC的发病密切相关〔10〕。本研究在以往临床研究及动物研究的基础上,结合现代理化技术、模型技术、动物治疗技术等,开展针对健脾五穴点按法治疗老年FC大鼠影响的研究,从“脑-肠轴”调节上阐述健脾五穴对老年FC的影响作用。

综上,经健脾五穴按压治疗后,提高了FC大鼠结肠组织中SP、CRF mRNA表达和蛋白活性,对脑肠肽的紊乱具有调节作用,促进了大鼠排便,改善了FC症状。