金丝桃苷通过抑制HSP90AA1抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭

郭晋祥 魏攀 吕会茹 李姣锋 王开武 张红

(洛阳职业技术学院 1内科教研室,河南 洛阳 471000;2生物化学教研室;3药理学教研室;4河南省人民医院重症医学科;5郑州大学第一附属医院心内科)

乳腺癌发病率和致死率在女性恶性肿瘤中分别居首位和第二位,已成为全球性的治疗问题〔1〕。尽管目前临床上相对早期和部分局部晚期乳腺癌患者经手术和(或)放化疗治疗后预后良好,然而乳腺癌的复发与转移依然棘手,同时放化疗手段常常导致严重的毒副作用,影响患者的治疗效果〔2～4〕。此外,乳腺癌发病的年轻化趋势及患者对治疗后生活质量要求的不断提高,对相关治疗药物的开发提出了更高要求。金丝桃苷是黄酮醇苷类化合物,既往研究发现,金丝桃苷具有抗炎、抗肿瘤等广泛药理作用,对包括肺癌在内的多种实体肿瘤具有抑制活性〔5～7〕,但金丝桃苷对乳腺癌的作用鲜有报道。本研究旨在观察金丝桃苷的网络药理学及对乳腺癌生物学特性的影响。

1 材料与方法

1.1细胞及实验动物 乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞株(武汉普诺赛生命科技有限公司)。Balb/c品系裸鼠16只(北京维通利华实验动物技术有限公司),SPF级,8～10周龄,体质量25～30 g。

1.2主要试剂 金丝桃苷(纯度≥98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),热休克蛋白(HSP)90α家族A类成员(HSP900AA)1过表达质粒(优宝生物),兔抗人HSP900AA1一抗(武汉菲恩生物科技有限公司),兔抗鼠Ki67一抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG二抗(美国CST公司),CCK-8检测试剂盒(美国Abbkine公司),Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司),Transwell小室(美国Corning公司)。

1.3金丝桃苷治疗乳腺癌相关靶点筛选 利用SwissTarget数据库和TargetNet数据库预测金丝桃苷的作用靶点,利用GeneCards数据库查询乳腺癌相关靶点以筛选金丝桃苷治疗乳腺癌作用靶点。

1.4金丝桃苷-乳腺癌靶点蛋白质相互作用(PPI)网络构建 将获得的金丝桃苷和乳腺癌的靶点取交集,并使用STRING平台构建金丝桃苷治疗乳腺癌的PPI网络,并进一步使用Cytoscape3.7.1软件进行可视化。

1.5基于癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析靶点基因与乳腺癌临床表型的关系 利用Uaclan在线分析筛选出TCGA数据库中在乳腺癌组织中表达差异及与生存相关的基因。下载TCGA_BRCA数据矩阵和临床信息,分析HSP900AA1表达及与乳腺癌临床特征的关系。

1.6细胞培养与转染 分别取MCF-7、MDA-MB-231细胞接种于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中,置于培养箱中常规培养,待汇合率达85%以上传代培养。采用Lipofectamine 2000将HSP900AA1过表达质粒转染MCF-7、MDA-MB-231细胞。

1.7裸鼠成瘤实验 取MCF-7细胞约1×107个重悬于100 μl的磷酸盐缓冲液(PBS)中,注射到裸鼠的第四对乳房垫诱导乳腺癌移植瘤;将16只裸鼠随机分为Control组和Hyperoside组各8只,Hyperoside组经腹腔注射50 mg/kg金丝桃苷,1次/2 d,共14 d;Control组注射等量生理盐水。每间隔2 d测量移植瘤体积(V),V=0.5×L×W2,L和W分别为测得的瘤体长、宽;治疗结束后处死裸鼠,剥离瘤体,并采用免疫组织化学法(IHC)检测移植瘤组织中Ki67表达。

1.8CCK-8检测细胞增殖 将MCF-7、MDA-MB-231细胞以约3 000个/孔密度接种至96孔板,放入培养箱中常规培养24 h后,MCF-7、MDA-MB-231细胞培养液中分别加入不同浓度金丝桃苷(75和100 μmol/L)处理,分别于继续培养24、48、72、96和120 h后,用细胞培养基1∶100稀释CCK-8试剂,加入100 μl的稀释液培养1 h后测定450 nm处各孔吸光度。

1.9Transwell实验检测细胞侵袭 将MCF-7、MDA-MB-231细胞以无血清培养基调节密度为1×105个/ml。于Transwell小室上室加入200 μl细胞悬液,下室加入600 μl含有不同浓度金丝桃苷(75和100 μmol/L)的10% FBS的培养基,培养48 h后使用结晶紫染色小室下层细胞并计数。

1.10划痕实验检测细胞迁移 将MCF-7、MDA-MB-231细胞接种至6孔板,5×105个/孔,待细胞铺满孔后利用200 μl移液枪头划一平直线,PBS清洗后显微镜观察划痕区域宽度并拍照。然后将MCF-7、MDA-MB-231细胞置于含有不同浓度金丝桃苷(75和100 μmol/L)的2% FBS的培养基中培养24 h,再次观察划痕宽度变化并拍照,Image Pro测量划痕宽度。

1.11Western印迹检测蛋白表达 收集处理后的MCF-7、MDA-MB-231细胞,PBS冲洗后冰上裂解提取总蛋白。二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白样品后,取40 μg蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脱脂牛奶室温封闭2 h,以β-actin为内参,加入HSP90AA1一抗4 ℃孵育过夜,TBST洗膜3次后加二抗室温下孵育2 h,电化学发光(ECL)法显色,ImageJ分析蛋白条带灰度值。

1.12统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、方差分析,两两比较使用SNK-q法。

2 结 果

2.1基于网络药理学预测金丝桃苷治疗乳腺癌靶点 共获得金丝桃苷-乳腺癌交集靶点24个,利用这24个生物靶点使用STRING工具绘制金丝桃苷治疗乳腺癌的最佳PPI网络(图1)。

图1 金丝桃苷-乳腺癌交集靶点的PPI网络

利用Ualcan在线工具分析这24个基因在乳腺癌中表达水平。结果表明,有ESR2、HSP90AA1、TOP1、PTPN1、DNMT1、CDC25B、FLT3、ESR1、MIF、TERT、CA 9共11个基因在乳腺癌中表达上调。对这11个基因进一步进行K-M曲线分析,结果表明热休克蛋白(HSP)90AA1 ESR1表达水平与乳腺癌生存状态相关。下载TCGA_BRCA表达矩阵和临床信息,乳腺癌组织中HSP90AA1 mRNA表达(31 320±550)较癌旁组织(23 410±432)明显上升(P<0.05),HSP90AA1表达与乳腺癌患者生存相关(P<0.05,图2),且随着T分期〔Ⅰ～Ⅱ期(28 210±764) vs Ⅲ～Ⅳ期(32 430±690)〕和临床分期〔T1(30 620±560) vs T2～4(33 530±1 472)〕进展,HSP90AA1表达水平依次升高(P<0.05)。此外,HSP90AA1表达与乳腺癌预后〔预后良好(28 492±1 204) vs 预后不良(35 174±1 682)〕密切相关(P<0.05)。本研究选择HSP90AA1进行研究。

图2 HSP90AA1高表达和低表达患者Kaplan-Meier生存曲线

2.2金丝桃苷对乳腺癌细胞体外增殖、迁移和侵袭的影响 CCK-8实验中,乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞活力随着金丝桃苷浓度升高而逐渐下降,IC50值分别为75.66、98.67 μmol/L。见图3。与Control组比较,金丝桃苷明显抑制MCF-7、MDA-MB-231细胞的体外增殖、明显增加划痕宽度,明显减少侵袭细胞数(P<0.05)。见表1、图4、表2。

表1 金丝桃苷对乳腺癌细胞体外增殖的影响

表2 两组乳腺癌细胞划痕宽度、侵袭细胞数比较

图3 CCK-8检测乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞对金丝桃苷治疗的敏感性

图4 金丝桃苷对乳腺癌细胞体外迁移和侵袭的影响(结晶紫染色,×200)

2.3金丝桃苷对乳腺癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响 与Control组比较,金丝桃苷组肿瘤体积、肿瘤重量明显下降,移植瘤组织中Ki67蛋白表达显著下调(P<0.01,P<0.001)。见图5、表3。

表3 两组移植瘤体积、重量及瘤组织中Ki67蛋白比较

图5 金丝桃苷对乳腺癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响(IHC,×400)

2.4金丝桃苷抑制HSP90AA1的表达 金丝桃苷在体外呈浓度、时间依赖性抑制乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞HSP90AA1蛋白表达(P<0.05),见表4、5,图6。

表4 不同浓度金丝桃苷对HSP90AA1表达的影响

表5 不同金丝桃苷处理时间对HSP90AA1表达的影响

图6 Western印迹检测不同浓度、处理时间金丝桃苷对HSP90AA1表达的影响

2.5金丝桃苷抑制HSP90AA1对乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响 与Control组比较,MCF-7和MDA-MB-231细胞转染HSP90AA1过表达质粒后,HSP90AA1蛋白表达显著上调,并促进其细胞活力、划痕宽度明显增大,侵袭细胞数明显减少(P<0.05);金丝桃苷处理显著抑制乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞的活力、增大划痕宽度、减少侵袭细胞数(P<0.05),而恢复HSP90AA1表达能够逆转金丝桃苷的上述抑癌功能(P<0.05),见表6、图7、图8。

表6 各组乳腺癌HSP90AA1蛋白表达、细胞活力、划痕宽度及侵袭细胞数比较

图7 各组细胞迁移、侵袭(结晶紫染色,×200)

1～4：Control组、金丝桃苷组、HSP90AA1组、金丝桃苷+HSP90AA1组图8 Western印迹检测4组HSP90AA1蛋白表达

3 讨 论

以往研究已经证实金丝桃苷对多种肿瘤细胞具有抗肿瘤活性〔6,7〕,然而由于肿瘤的异质性,金丝桃苷对乳腺癌细胞的作用尚不清楚。HSP90AA1属于HSP90家族成员。HSP90AA1经历了一个与其ATP酶活性相关的功能循环,这个周期可能引起特定蛋白的构象变化,从而引起其激活。此外,HSP90AA1可以与多种共同伴侣相互作用,调节其底物识别、ATP酶周期和伴侣功能〔8,9〕。在众多恶性生长和侵袭性肿瘤样本中检测到高水平的HSP90AA1表达〔10〕。近年来利用蛋白组学等方法获得在肿瘤与正常组织中的差异表达分子或基因,有助于指导相关靶向药物的研发。有研究者应用生物信息学分析发现,HSP90AA1 mRNA在乳腺癌组织中表达上调,且其高表达与较短的总生存期和无进展生存期密切相关〔11〕。本研究结果与贾真等〔11〕研究结果相一致。

肿瘤细胞的增殖能力异常使得肿瘤能在体内能非正常生长〔12〕。之前的报道〔13〕显示,金丝桃苷能抑制肺癌细胞的增殖与迁移。在本研究体外细胞实验中,金丝桃苷呈剂量依赖性抑制了MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的增殖速率。研究〔14,15〕表明,Ki67是反映细胞增殖能力的重要标志,本研究提示金丝桃苷可能通过内源性途径抑制乳腺癌细胞增殖。本研究进一步证实金丝桃苷具有明显的抗肿瘤活性。本研究结果表明,HSP90AA1是金丝桃苷抗乳腺癌的重要功能靶点。

综上,HSP90AA1在乳腺癌表达上调,并与乳腺癌分期晚和不良预后密切相关;此外,金丝桃苷能抑制乳腺癌的增殖、迁移和侵袭,其机制与抑制HSP90AA1表达有关。