柴胡皂苷 d 对SH-SY5Y细胞体外抑制作用及机制

李妍 张红 纪朋艳 蔡同建 陈泉瑛 吕权洲

(1吉林医药学院基础医学院,吉林 吉林 132013;2陆军军医大学军事预防医学系;3吉林医药学院药学院)

神经母细胞瘤(NB) 源于胚胎时期的原始交感神经或肾上腺髓质,可发生于颈部、腹部、肾上腺及盆腔等多个部位〔1〕。NB具有高度恶性,且肿瘤细胞侵袭性强,约70%的患者伴有转移性疾病,临床上NB的治疗以手术治疗为主,辅以放疗和化疗,但治疗效果不佳〔2,3〕。传统中药材柴胡是伞形科植物柴胡或狭叶柴胡的干燥根。《神农本草经》将柴胡列为上品,其在中医临床上的用药史已达两千多年。因具有清热解表、调肝理气、扶阳正本等功效,柴胡被广泛用于治疗感冒发热、寒热往来、肝郁气滞等症。柴胡皂苷含量高,种类多,是柴胡的主要活性成分。现代药理学研究发现,柴胡皂苷具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、神经调节和免疫调节等多种作用〔4～7〕。柴胡皂苷(SS)d是从柴胡中提取的一种三萜皂苷。大量研究证实,SSd具有广泛的抗瘤作用,能够明显抑制肝癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、黑色素瘤细胞等多种肿瘤细胞的生长增殖〔8～11〕。本文前期研究证实SSd能够促进NB的SH-SY5Y细胞NB凋亡〔12〕。但SSd诱导SH-SY5Y细胞凋亡的具体分子机制尚不明确。本研究旨在探讨SSd引起SH-SY5Y细胞凋亡的信号转导通路及其具体分子机制。

1 材料与方法

1.1细胞系及主要试剂 SH-SY5Y细胞购自中国科学院上海生命科学研究院;SSd购自中国药品生物制品检定所;杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)购自美国Hyclone公司;二甲基亚砜(DMSO)购自沈阳市华东试剂厂;胎牛血清购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司;活性氧(ROS)荧光探针(DCFH-DA)试剂盒购自上海碧云天生物技术公司;丙二醛(MDA)细胞测定试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;细胞周期蛋白(Cyclin)D1抗体购自美国cell signaling technology公司。

1.2仪器 细胞培养箱购自北京东方安若生化科技有限公司;倒置显微镜购自日本Olympus公司;超净台购自苏州净化仪器厂;低温高速离心机购自美国sigma公司;电泳仪及转印槽购自北京六一仪器厂;细胞培养瓶购自加拿大JET公司。

1.3细胞培养及传代 将SH-SY5Y细胞株置于含DMEM(内含体积分数为10%的灭活胎牛血清,100 U/ml青霉素及100 U/ml链霉素)的无菌细胞培养瓶中,在体积分数为5%CO2的37 ℃恒温培养箱中常规培养。每2天进行1次传代。

1.4SSd药物配制及分组 准确称取SSd标准品粉末,将SSd标准品粉末溶于含0.3% DMSO的DMEM,配制成终浓度分别为0(对照组)、4、8、10 μmol/L 的SSd组。

1.5细胞ROS水平检测 细胞分组同上,取对数生长期的SH-SY5Y细胞,接种于24孔板中,恒温培养箱中培养48 h,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞,按照试剂盒说明书进行操作,通过激光共聚焦显微镜瞬时测定2′,7′-二氯荧光素(DCF)含量,使用Image J软件对荧光强度进行分析,分析不同浓度SSd处理条件下细胞内ROS含量,检测各组荧光强度。

1.6细胞LDH含量测定 细胞接种于24孔板内,SSd处理SH-SY5Y细胞48 h,收集细胞培养液,取其上清液,按照试剂盒说明书进行操作,然后采用酶标仪分别检测细胞上清液中LDH活性。

1.7细胞MDA含量测定 SH-SY5Y细胞接种于24孔板内,待贴壁后加入不同浓度的SSd生长48 h后,4 ℃离心,取其上清液,按试剂盒说明书进行操作,酶标仪检测各组吸光度(OD)值。

1.8Western印迹检测 SH-SY5Y细胞中CyclinD1、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2及Bcl-2相关X基因(Bax)蛋白表达：处理48 h后,胰酶消化,收集细胞,提取细胞总蛋白并采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。每孔加入50 μg蛋白溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,4 ℃低温条件下电转。5%脱脂奶粉封闭,将CyclinD1、Bax及Bcl-2一抗分别用封闭液按1∶1 000稀释后加于NC膜上,4 ℃孵育过夜。Tris盐酸缓冲液吐温(TBST)洗涤后加入辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗,孵育2 h后进行成像,以β-actin为内参,后显影、定影。图像经GeneGenius凝胶成像分析系统进行分析。

1.9统计学分析 采用SPSS20.0软件进行重复测量方差分析,组间比较采用Dunnett-t检验。

2 结 果

2.1SSd影响SH-SY5Y细胞ROS水平及MDA含量 与对照组相比,8、10 μmol/L SSd组细胞中ROS水平及MDA含量明显增加(P<0.01,P<0.05),且有随SSd浓度增加而升高趋势。见图1、表1。

表1 各组SH-SY5Y细胞ROS水平、LDH活性、MDA、CyclinD1、Bcl-2及Bax蛋白表达比较

图1 不同浓度SSd对SH-SY5Y细胞ROS水平的影响(DCFH-DA染色,×200)

2.2SSd影响SH-SY5Y细胞LDH活性 与对照组比较,4、8和10 μmol/L SSd组LDH活性显著升高(P<0.05,P<0.01),且呈剂量依赖关系。见表1。

2.3SSd影响SH-SY5Y细胞CyclinD1、Bax和Bcl-2 蛋白表达 与对照组比较,8、10 μmol/L SSd组Bcl-2表达显著降低(P<0.01);4、8 和10 μmol/L SSd组Bax表达显著升高,CyclinD1表达显著降低(P<0.05,P<0.01),且SSd作用呈剂量依赖性。见表1、图2。

1～4：对照组、4、8、10 μmol/L SSd组图2 各组SH-SY5Y细胞CyclinD1、Bcl-2和Bax蛋白表达水平

3 讨 论

迄今为止,NB的病因未完全阐明,目前认为其发病机制与环境因素和遗传有关〔13〕。寻找有效且不良反应小的治疗药物对提高 NB患者的生存质量有重要意义,SSd是从中药柴胡中提取纯化的主要生物活性成分之一。Tang等〔14〕研究发现SSd可抑制肺癌细胞增殖并诱导其凋亡。同时,研究表明SSd通过下调多糖耐药蛋白(MDR)1和P-糖蛋白(gp)的表达,可增强乳腺癌MCF-7细胞对阿霉素的敏感性〔15〕。另有研究证实,SSd可抑制胃癌细胞SGC-7901的迁移能力且呈剂量效应关系〔16〕。上述实验结果均表明SSd具有广泛的抗肿瘤作用。

氧化应激是指机体在各种理化因素作用下生成较多的ROS自由基和活性氮(RNS)自由基等活性分子,导致机体的氧化系统和抗氧化系统的平衡被破坏,引起机体损伤。当氧分子与单电子反应时可生成超氧阴离子,后者可进一步与电子反应生成过氧化氢、羟自由基等物质,这些氧化性质活跃的含氧分子统称为ROS。药物作用、细菌感染及组织缺氧等情况可导致细胞产生大量ROS〔17〕。MDA为细胞在各种理化因素作用下膜相关的脂质发生过氧化反应生成的产物,为机体发生氧化应激损伤的重要标志物,可代表细胞氧化损伤程度〔18〕。LDH参与机体的能量代谢,能够催化乳酸与丙酮酸之间的相互转化。LDH为细胞内酶,当细胞膜损伤时其细胞外含量增加,因此LDH的释放量是判断细胞膜的完整性及发生氧化应激损伤的重要指标〔19〕。本研究发现,SSd可通过增加SH-SY5Y细胞的氧化应激水平损伤细胞。

细胞增殖是生物传代和生长发育的基础。肿瘤的发病机制与细胞生长增殖相关基因的异常表达、功能失活、突变等改变密切相关。细胞分裂是增殖的关键环节,真核细胞的分裂周期主要分为分裂间期(G1、S、G2期)和有丝分裂期(M期),细胞在G1期合成所需营养物质,在S期进行DNA复制,在G2期进行线粒体及其他细胞器的复制。CyclinD1广泛存在于真核细胞中,是Cyclin家族中的重要成员,能够促进细胞从G1期向S期转化。研究显示,CyclinD1与多种肿瘤的发生、发展密切相关,在多种肿瘤细胞中均可检测到高表达的CyclinD1〔20〕。本实验发现,4～10 μmol/L SSd均可明显抑制SH-SY5Y细胞中CyclinD1表达,提示SSd对SH-SY5Y细胞的增殖抑制作用与降低CyclinD1蛋白表达密切相关。

细胞发生氧化应激损伤是引起细胞凋亡的重要因素,过量的ROS会破坏线粒体膜的完整性,引起线粒体膜电位丧失,进而诱发细胞凋亡〔21〕;同时,有研究证实细胞凋亡与细胞增殖周期异常调控密切相关,在缺氧、某些毒物和药物的作用下,细胞周期蛋白表达被抑制,细胞启动凋亡程序〔22〕。本研究证实,SSd不仅能够引起SH-SY5Y细胞发生氧化应激反应及CyclinD1表达抑制,同时能够促进Bax蛋白表达,抑制Bcl-2蛋白表达,提示SSd可能通过诱导NB的SH-SY5Y细胞发生氧化应激损伤并引起细胞周期调控异常进而使凋亡相关蛋白表达异常,最终导致细胞凋亡。