c-Myc、PD-L1、CAIX在肺腺癌中表达及其临床意义

李子腾 袁江 李鹏 冯凯

(1滨州医学院第一临床医学院,山东 烟台 264003;2滨州市人民医院胸外科)

肺腺癌是男性和女性肺癌患者中最普遍的组织学亚型,占肺癌总数的35%～40%,近年来发病率显著上升,尤其在女性中增长迅速,已超过鳞癌成为最常见的病理型〔1〕。在一些北欧国家,女性患者的肺腺癌发病率已超过男性。肺腺癌的转移与侵袭能力是临床分期的重要依据。肿瘤的转移由一系列连续、相互关联的步骤组成,多个基因与环节牵涉其中,其中肿瘤细胞的免疫逃逸与肿瘤细胞对缺氧环境的适应在转移中发挥重要作用。c-Myc作为一种原癌基因,在许多肿瘤中过表达,与女性乳腺癌关系密切〔2〕,在肺腺癌中亦有表达〔3〕。c-Myc可增强程序性死亡配体(PD-L)1表达,使免疫系统丧失对肿瘤细胞的监管〔4〕。并参与营造实体肿瘤细胞微环境缺氧状态,调控碳酸酐酶(CA)Ⅸ表达升高,诱导癌细胞在缺氧环境中的适应性变化〔5〕。全基因组分析研究表明,数千个基因表达可能直接受c-Myc调控〔6〕。PD-L1、CAⅨ是c-Myc的下游因子。但c-Myc与其下游因子在肺腺癌中的研究尚不充分。本实验拟分析c-Myc、PD-L1、CAⅨ在肺腺癌组织与良性肺组织中蛋白质的表达及临床意义。

1 材料与方法

1.1材料 选取滨州市人民医院于2021年1月至2022年12月因外科手术切除或活检的肺腺癌病理标本52例,所有患者术前没有接受任何治疗且病理诊断明确。另设20例良性肺组织(经病理证实)为对照组,以上标本均经甲醛固定,石蜡包埋。其中肺腺癌患者中位年龄65岁;根据第8版AJCC肿瘤分期手册严格分期,该研究已得到所在单位伦理学委员会批准。

1.2相关试剂 兔抗人c-Myc、兔抗人PD-L1、鼠抗人CAⅨ购自基因科技(上海)股份有限公司,柠檬酸盐抗原修复液、Maxvison检测试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂购自福建迈新生物技术有限公司。

1.3实验方法 采用免疫组化法,标本切片4 μm,经烘烤,脱蜡,水化后进行高温高压抗原修复,封闭内源性过氧化氢酶后,滴加一抗湿盒中4 ℃过夜。次日弃掉一抗,滴加二抗,并用DAB染色,苏木素复染、组织脱水、石蜡透明。以已知阳性的切片作为阳性对照,磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。

1.4结果判定 c-Myc蛋白以细胞核与细胞质呈现棕黄色颗粒为阳性标记,CAⅨ蛋白主要定位在细胞膜,阳性者可观察到胞膜染色为棕黄色,结果判读采用半定量积分法,按每张切片着色深浅及阳性细胞比例进行判断,染色阳性程度：无染色0分,浅黄色1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分;阳性细胞百分比：<5%为0分,5%～24%1分,25%～50%为2分,>50%为3分。两个定量数字相乘,总分值<2为阴性,≥2为阳性。PD-L1蛋白表达于细胞膜,阳性者可见细胞膜棕黄色染色。采用肿瘤比例评分(TPS),PD-L1表达阴性者TPS<1%,PD-L1表达阳性者TPS≥1%,其中TPS≥50%为PD-L1强阳性。

1.5统计学分析 采用SPSS26.0软件进行χ2检验、Spearman检验。

2 结 果

2.1c-Myc在肺腺癌与良性肺组织中的表达 肺腺癌组织c-Myc阳性表达23例(44.23%),在良性组织中表达3例(15.00%),差异有统计学意义(χ2=5.350,P=0.021)。不同临床分期、有无淋巴结转移的阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05)。c-Myc在不同性别、不同年龄、有无吸烟史、不同肿瘤分化程度中无明显差异,见表1。

表1 c-Myc、PD-L1、CAⅨ阳性表达与肺腺癌临床病理参数的相关性〔n(%)〕

2.2PD-L1在肺腺癌与良性肺组织中的表达 肺腺癌组织PD-L1阳性表达19例(36.54%),在良性组织中无表达,差异有统计学意义(χ2=9.927,P=0.002)。有无吸烟、不同肿瘤分化程度阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05)。PD-L1在不同性别、不同年龄、不同TNM分期、有无淋巴结转移中无明显差异(P>0.05),见表1。

2.3CAⅨ在肺腺癌与良性肺组织中的表达 肺腺癌组织CAⅨ阳性表达14例(26.92%),在良性组织中无表达,差异有统计学意义(χ2=6.684,P=0.010)。不同肿瘤分化程度阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05)。CAⅨ在不同性别、不同年龄、有无吸烟史、不同TNM分期、有无淋巴结转移中无明显差异,见表1。

2.4c-Myc、PD-L1、CAⅨ三者在肺腺癌中表达相关性 c-Myc与PD-L1、CAⅨ(r=0.691、0.594)、PD-L1与CAⅨ均呈正相关(r=0.710,均P<0.05)。

3 讨 论

肺癌患者生存时间与其临床诊断发现的早晚密切相关。虽然低剂量螺旋CT的普及及人群健康意识的提高对早期发现、改善预后、降低肺癌死亡率意义重大,我国肺癌年龄标化5年生存率略有上升,但仍不超过20%,总体5年生存率仍偏低〔7〕,这主要是因为中国肺癌患者中60%是Ⅲ～Ⅳ期患者〔8〕。研究肺腺癌的分子机制,探究有助于肺腺癌诊治与预后判断的分子位点,对进一步提高肺腺癌的治愈率、降低死亡率等方面有重大意义。

原癌基因c-Myc属于骨髓细胞瘤病毒癌基因Myc家族,作为一种原癌基因调节多种在肿瘤中至关重要的基因表达〔9〕。c-Myc可以通过调节PD-L1的表达,增强肿瘤对机体免疫应答的抑制作用。Xu等〔10〕发现肝癌中PD-L1在翻译阶段受到c-Myc的调节,增强PD-1/PD-L1介导的免疫逃逸,在c-Myc依赖的肿瘤进展中发挥关键作用〔11〕;Casey等〔12〕研究显示,无论体内或体外实验,c-Myc失活均会导致PD-L1 mRNA水平和蛋白质水平及免疫荧光快速下调。PD-L1的下调增强了抗肿瘤免疫反应,肿瘤生长停止。

c-Myc还参与癌细胞的代谢重编程〔13〕,可直接激活多个糖酵解及谷氨酰胺分解代谢相关基因的表达,进而直接促成癌细胞的Warburg 效应(有氧糖酵解),诱导代谢重编程以促进肿瘤发生〔14〕。而糖酵解的酸性代谢产物造成的细胞内酸化又进一步刺激了CAⅨ表达〔15〕。CAⅨ是一种跨膜二聚体锌金属酶,在癌细胞的pH调节中发挥关键作用,使这些细胞能够适应肿瘤微环境的不利条件〔16〕。Hua等〔17〕研究发现,在非小细胞肺癌中c-Myc可通过上调长非编码RNA LINC01123促进肿瘤增殖与有氧糖酵解;Yang等〔18〕发现在胰腺导管腺癌中糖酵解的活化使CAⅨ的表达上调。

同时,缺氧环境对肿瘤细胞的免疫逃逸存在促进作用〔19〕。Karimi等〔20〕通过研究缺氧条件下培养的脑膜瘤细胞,利用免疫组化法发现PD-L1与CAⅨ的表达具有相关性;Brooks等〔21〕研究发现,在头颈癌中肿瘤微环境缺氧激活HIF信号传导,CAⅨ表达增加,并上调PD-L1等免疫细胞抑制配体的表达。Koh等〔22〕在一项基于免疫组织化学和RNA测序数据的研究中发现PD-L1蛋白和mRNA的表达与CAⅨ的表达显著相关。

本实验结果显示肺腺癌中c-Myc表达水平升高,继而增加PD-L1、CAⅨ等基因的表达参与肿瘤的免疫逃逸、肿瘤细胞糖酵解代谢等过程,促进肺腺癌的发生、发展与转移。联合检测这3个指标可能有助于患者预后的评估。虽然直接靶向c-Myc存在困难,但间接靶向c-Myc是治疗肺腺癌的研究方向之一,本研究提示选择性抑制c-Myc下游因子的表达联合抗PD-L1免疫疗法可作为一种治疗肺腺癌的新策略。