iNOS在老年NSCLC患者中表达及其与患者临床病理特征和预后的关系

徐佳 孙平 王海燕 张云霞

(杭州市第三人民医院 1呼吸内科,浙江 杭州 310009;2外科)

肺癌是常见的恶性肿瘤,随着环境污染、生活方式改变及老龄化加剧,其患病率在我国呈上升趋势,严重影响人们身心健康〔1,2〕。据统计表明,非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌总数80%以上,在全球范围内具有较高的发病率和病死率,不仅影响患者生存质量,且威胁患者生命健康〔3〕。NSCLC作为最常见的肺癌组织学类型,具有肿瘤生长速度快的特点,且肿瘤细胞容易从原发部位扩散及转移至远隔器官,从而造成患者预后不佳〔4,5〕。大部分NSCLC由于症状较为隐匿,导致患者确诊时病情已处于中晚期〔6〕。故而,寻找新的分子标志对NSCLC高危人群进行有效识别,深入了解NSCLC的生物学机制,对NSCLC患者的治疗及预后改善具有重要意义。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)可催化合成一氧化氮,在多种恶性肿瘤中异常表达,且与其预后密切相关。目前,关于iNOS在NSCLC患者中表达研究甚少,缺乏可靠的临床参考价值。本研究旨在探讨iNOS在老年NSCLC患者中表达及其与临床病理特征和预后的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择杭州市第三人民医院于2018年1月至2019年1月行手术切除的老年NSCLC患者100例,取患者癌组织及其癌旁正常组织;年龄65～83岁,平均(74.32±6.28)岁。纳入标准：(1)依据《中国临床肿瘤学会(CSCO)原发性肺癌诊疗指南(2018版)》〔7〕标准;(2)经术后病理学证实为NSCLC;(3)具备完整的临床和随访资料。排除标准：(1)伴其他部位恶性肿瘤者;(2)伴重要脏器衰竭,如严重呼吸道疾病、肾病、肝病或无法控制的糖尿病、高血压等慢性疾病者;(3)术前接受过放化疗者;(4)精神疾病者。

1.2免疫组化法测定iNOS蛋白表达 采用免疫组织化学法测定iNOS蛋白表达。鼠抗人iNOS多克隆抗体(英国Abcam公司),SP免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。具体方法：标本均经中性甲醛固定,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,连续切片4 μm。经60 ℃烤片切片30 min,二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化,采用3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶,抗原采用柠檬酸钠缓冲液煮沸修复,放于室温环境下自然冷却。再以5%山羊血清室温封闭30 min,滴加iNOS蛋白一抗,4 ℃孵育过夜。再滴加辣根过氧化物酶标记的二抗,放置于37 ℃孵育20 min。采用DAB显色,自来水冲洗,苏木素复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固,显微镜下观察。

1.3结果判定 每张切片随机选取200倍不重叠视野5个,计数阳性细胞数和细胞总数,统计阳性细胞比例。iNOS蛋白定位于细胞核,主要呈浅黄色至棕黄色颗粒状。按照阳性细胞比例和染色强度评分乘积综合评价。阳性细胞比例：0分为无阳性细胞;1分为阳性细胞≤10%;2分为阳性细胞11%～30%;3分为阳性细胞31%～50%;4分为阳性细胞>50%。染色强度：0分为阳性细胞无着色;1分为阳性细胞浅黄色;2分为阳性细胞棕黄色;3分为阳性细胞棕褐色。以总分≤3分表示(-),4～6分表示(+),7～9分表示(),≥10分表示()。

1.4随访情况 随访至2023年1月31日,通过查阅医院病案记录、电话、微信及门诊等方式进行随访,记录患者总生存期(OS)。

1.5统计学处理 采用SPSS25.0软件进行t、χ2检验,绘制生存曲线并行多因素Logistic回归分析。

2 结 果

2.1癌组织与癌旁组织iNOS阳性表达比较 癌组织iNOS阳性表达〔65例(65.00%)〕显著高于癌旁组织〔17例(17.00%);χ2=47.623,P<0.05〕。

2.2不同病理特征iNOS阳性表达比较 不同性别、吸烟史、肿瘤直径、组织学分化iNOS阳性表达差异无统计学意义(P>0.05);Ⅲ～Ⅳ期iNOS阳性表达显著高于Ⅰ～Ⅱ期,有淋巴结转移iNOS阳性表达显著高于无淋巴结转移(P<0.05),见表1。

2.3NSCLC患者iNOS表达与预后关系 随访至2023年1月31日,随访时间19～60个月。NSCLC患者iNOS阳性表达OS时间(30个月)显著短于iNOS阴性表达(39个月,P<0.05),见图1。

图1 NSCLC患者iNOS表达与预后关系

2.4多因素Logistic回归分析影响预后独立危险因素 Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移和iNOS阳性表达为影响预后独立危险因素(P<0.05),见表2。

表2 多因素Logistic回归分析影响NSCLC患者预后独立危险因素

3 讨 论

目前,关于NSCLC具体发病机制尚未完全阐明,而NSCLC的侵袭性转移是导致患者最主要死亡原因,且是当今NSCLC治疗的重要与难点〔7～9〕。现阶段,针对NSCLC尚无特效的治疗手段,且患者5年生存率较低〔10～12〕。因此,早期诊断和治疗NSCLC患者是提高生存率的关键〔13,14〕。

近年来研究发现,肺内的巨噬细胞存在两种类型,其中M1型巨噬细胞呈iNOS阳性,而argenase 1呈阴性;其能够被脂多糖、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ激活,从而产生炎性介质白细胞介素-12、一氧化氮和iNOS,其中一氧化氮能够与过氧化物结合,从而形成一种细胞毒性过氧亚硝酸盐〔15〕。iNOS在正常生理条件下几乎不表达,而在病理状态下及在诱导因素如脂多糖、白细胞介素等细胞因子诱导下,使iNOS诱导合成一氧化氮相比于正常生理条件下的一氧化氮浓度高1 000倍左右,且认为iNOS诱导生成的一氧化氮可能在肿瘤发生、发展中具有重要促进作用。近年来,研究显示iNOS在多种肿瘤中异常表达,且认为iNOS对多种恶性肿瘤的血管生成、侵袭及生长具有一定影响〔16,17〕。王光辉等〔18〕研究表明,收集148例不同乳腺病理组织及正常乳腺组织20例,其中iNOS在乳腺正常组织中无阳性表达;而在浸润性乳腺癌组织中阳性率为78.8%,在原位癌组织中阳性率为52.5%,在乳腺不典型增生组织中阳性率为25.0%,且存在显著差异;5年无病生存率,原位癌中iNOS染色阳性低于阴性,可见在乳腺癌早期阶段iNOS即表达出现升高,其可作为乳腺癌早期诊断及评估预后的一种潜在指标。王莉等〔19〕研究表明,iNOS在宫颈癌组织中呈过表达,且与淋巴结转移密切相关,认为可作为宫颈癌生物学行为及预后评估的指标。赵娜等〔20〕研究表明,收集行手术切除的卵巢上皮性肿瘤及正常卵巢组织96例患者临床资料,恶性肿瘤患者中iNOS阳性表达率高于交界性肿瘤患者、良性肿瘤患者及正常卵巢组织患者,且恶性肿瘤患者中不同临床分期和病理分级间iNOS蛋白表达具有显著差异,且分期越高iNOS蛋白阳性率越高,可见卵巢上皮性肿瘤患者中iNOS蛋白呈高表达,认为其可成为基因治疗的靶点,对卵巢上皮性肿瘤患者发生、发展及预后具有预测作用。