MTHFR基因rs1801133 位点多态性与脑卒中的相关性

朱俊杰 李建民 吴再辉 刘少鹏 龚泽华 刘俊杰

(华北理工大学 1临床医学院,河北 唐山 063000;2附属医院神经外科)

脑卒中是急性脑血管疾病,脑内缺血或出血而导致的脑组织受损,从而致残或致死,分为缺血性脑卒中(IS)和出血性脑卒中(ICH)。脑卒中是仅次于缺血性心脏病的第二大死因,其疾病负担较高〔1〕。脑卒中高发病率与高同型半胱氨酸血症(Hhcy)和高尿酸血症有关。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是人体内叶酸-甲硫氨酸代谢过程中的关键酶,与叶酸的代谢密切相关,后者在DNA、RNA和蛋白质甲基化及DNA合成和维持过程中发挥重要作用,与此同时,rs1801133位点多态性导致的其生成酶活性和热稳定性下降易导致Hhcy〔2〕。在人类的染色体中,MTHFR 基因位于1号染色体1p36.3上,包括11个外显子和10个内含子,cDNA长2.2 kb,其多态性高。MTHFR基因rs1801133 位点,即 MTHFR C677T,其多态性与多种疾病(血管病、癌症、神经病学、糖尿病、银屑病等)有关,多态性的流行病学因地域和种族而异〔2〕。MTHFR C677T基因于第677位碱基对上胞嘧啶由胸腺嘧啶取代,导致丙氨酸转化为缬氨酸。这一突变降低MTHFR活性和耐热性,杂合型 CT 型、突变 TT 型酶的活性分别约为65%、30%的CC型酶的活性〔3〕,引起血清叶酸水平异常,进而导致Hhcy。MTHFR C677T位点的TT型人群相较于CC型和CT型人群,体内尿酸水平显著较高〔4〕,该基因亦被认为是高尿酸血症和痛风相关基因。一项纳入1 470例研究对象的Meta分析中,MTHFR C677T基因型和尿酸水平与高尿酸血症显著相关〔5〕。有项对患有认知障碍的老年人群的研究表明：血清尿酸和血清同型半胱氨酸呈正相关,协同导致脑血管病变,饮食干预将有助于改善血管病变导致的认知能力下降,研究认为尽管MTHFR C677T 的各基因型对同型半胱氨酸有影响,但是对尿酸水平可能无显著影响〔6〕。

关于MTHFR基因rs1801133 位点多态性与脑卒中的相关性,在近年来的研究中存在矛盾的观点。有研究表明MTHFR(677C>T 和 1298A>C)多态性使个体易患IS〔7〕;但是亦有研究〔8〕表明MTHFR基因rs1801133 位点多态性与ICH的易感性之间没有关联。一项针对莫斯科地区的研究,未发现MTHFR基因rs1801133位点多态性与IS风险之间存在关联〔9〕。基于印度北部人群的病例对照研究说明MTHFR C677T 基因多态性与ICH或IS无关,然而同型半胱氨酸水平升高与 IS 患者的 MTHFR C677-TT 基因型相关〔10〕。

因此,考虑到同一基因的突变在不同人群中差异较大及区域的遗传差异性,使得MTHFR基因rs1801133 位点多态性地区差异性较大,本研究旨在通过探讨MTHFR 基因rs1801133位点多态性对唐山地区人群脑卒中的影响,以期基于该位点多态性为预防脑卒中提供相关依据。

1 资料与方法

1.1研究对象 选取2018年11月1日至2021年6月30日华北理工大学附属医院脑卒中患者194例为病例组。病例组根据脑卒中类型,又分为IS组和ICH组。同期无脑卒中病史体检者221例为对照组。纳入标准：①病例组符合诊断标准,参考《中国急性缺血性脑卒中诊治指南 2018》〔11〕《各项脑血管诊断要点》〔12〕《中国脑出血诊治指南(2019)》〔13〕,或曾有过确诊脑卒中病史。②对照组研究对象无新发脑卒中和该病病史。③研究对象具有详细可靠的临床病历资料。④唐山地区常住人群且父母辈均为本地人,汉族。排除标准：①恶性肿瘤、颅脑外伤、免疫疾病、感染疾病、凝血功能障碍、脑血管畸形。②药物相关性脑卒中：抗凝药物、抗血小板药物等。③纳入ICH组的不包括IS治疗过程中所致的ICH。本研究经华北理工大学附属医院伦理委员会审查批准,患者及家属均签署知情同意书。

1.2资料记录与血样采集 研究对象均记录年龄、性别、体质量指数、吸烟史、高血压史、饮酒史、糖尿病史、家族史,是否为高尿酸血症、Hhcy及脑卒中类型(IS/ICH)。取研究对象晨起空腹取外周静脉血20 ml于抗凝管中置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3MTHFR基因rs1801133 位点多态性检测 上游引物5′-GCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT-3′,下游5′-CCTCAAAGAAAAGCTGCGTGATG-3′,野生型探针对应基因突变位点C,其序列5′-3′：VIC-ATGAAATCGGCTCCCGC-NFQ,突变型探针对应基因突变位点T,其序列5′-3′：FAM-ATGAAATCGACTCCCGC-NFQ〔14〕。应用 DNA 提取试剂盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕,操作按说明书进行。紫外分光仪测定提取的 DNA 样品 OD260/OD280 比值,若OD比值在 1.8～2.0,则纯度符合要求。PCR 扩增反应体系：无菌水9.5 μl,DNA 模板2 μl,上下游引物各1.0 μl(10 pmol/μl),野生型和突变型探针各0.6 μl(10 pmol/μl),PCR Mix 12.5 μl(含除外模板、引物与探针的PCR扩增必需组分)。PCR反应条件：95 ℃ 3 min预变性,95 ℃ 45 s变性,53 ℃ 45 s退火,72 ℃ 1 min延伸,以上步骤30个循环,72 ℃ 5 min延伸,于4 ℃保存。采用实时荧光定量PCR仪检测不同样本 MTHFR基因rs1801133位点多态性,检验结果由相应软件进行判读。

1.4统计学分析 采用R4.0.2软件进行t检验、非参数秩和检验、χ2检验。基因型的两两比较采用FDR法校正。检验Hardy-Weinbrey遗传平衡定律,构建多因素二元Logistic回归分析。

2 结 果

2.1两组基线资料对比 两组年龄、体质量指数、吸烟、饮酒、高尿酸血症及Hhcy差异有统计学意义(P<0.05);两组性别、高血压、糖尿病、脑卒中家族史差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 对照组与病例组一般资料比较(n)

2.2MTHFR 基因 rs1801133 位点多态性

2.2.1rs1801133位点检测结果及Hardy-Weinbrey遗传平衡定律检验 病例组、对照组、IS组、ICH组均满足Hardy-Weinbrey遗传平衡定律(χ2=0.49、2.90、0.36、0.04,P=0.48、0.09、0.55、0.84),提示研究对象具有群体代表性。

2.2.2rs1801133位点多态性比较 IS组和ICH组基因型与等位基因差异无统计学意义(P>0.05)。IS组、ICH组、病例组分别与对照组比较,基因型与等位基因差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。建立5种遗传模型,除隐性模型(TT vs CC+CT)在ICH组和对照组间无统计学差异外,其余均有统计学差异(P<0.05),提示MTHFR基因rs1801133位点T等位基因携带者发生脑卒中风险增加,见表3。

表2 IS组与ICH组MTHFR基因 rs1801133位点比较〔n(%)〕

表3 各组5种基因模型OR(95% CI)

2.2.3脑卒中危险因素 以MTHFR基因rs1801133 位点CT型、TT型及饮酒、糖尿病、高尿酸血症、脑卒中家族史、Hhcy、吸烟、高血压、体质量指数等多因素为自变量,以脑卒中为因变量,进行二元Logistic 回归分析。结果显示：使得脑卒中风险增加的因素有TT型、饮酒、吸烟、高尿酸血症、体质量指数、年龄(P<0.05)。见表4。MTHFR 基因 rs1801133 位点TT型可作为脑卒中患病独立预测因素。

3 讨 论

本研究所纳入研究对象符合Hardy-Weinbrey遗传平衡定律,说明所纳入研究对象可代表唐山地区人群的情况。本研究结果表明,MTHFR基因rs1801133 位点多态性与脑卒中有相关性。Escobedo等〔15〕对墨西哥人群中MTHFR基因rs1801133多态性与脑卒中的相关性研究中表明,该位点变体的杂合子(CT型)比纯合子(TT型)受试者的脑卒中风险高3倍;Mazdeh等〔16〕在对伊朗人群研究中表明,在隐性模型中,rs1801133与脑卒中风险显著相关〔OR(95%CI)=1.89(1.12～3.20),P=0.03〕;Chang等〔17〕对老年人IS风险增加的关联研究表明,MTHFR C677T 变体增加了IS的风险,进一步亚组分析表明中国人群的MTHFR C677T 变异与较高的IS风险相关。Yuan等〔18〕研究表明MTHFR基因rs1801133位点不同基因型患者,体内血浆同型半胱氨酸水平呈现TT基因型>CT基因型>CC基因型的趋势。结合上述可以推测,MTHFR基因rs1801133位点多态性对脑卒中易发性的影响(即危险程度大小)可能因种族、地域和年龄而有所差异,与不同基因型对Hhcy的差异性影响有关。

本研究结果提示,对于MTHFR基因rs1801133位点杂合 CT 型和突变 TT 型的人群应及早预防脑卒中的发生。Leng等〔19〕研究表明：MTHFR C677T多态性和饮食模式对中国人群Hhcy具有交互作用,其中零食模式和高肉模式两种饮食模式与Hhcy风险升高有关,与MTHFR 677TT之间呈协同效应。叶酸和维生素(Vit)B12水平低的高血压患者首次发生IS的风险显著更高;叶酸治疗在低叶酸和VitB12的CC基因型患者及高叶酸和VitB12的 TT 基因型患者中的效果最大〔20〕。由此可说明：从调整饮食模式、补充叶酸和预防及治疗Hhcy的角度可能可以预防CT、TT基因型脑卒中发生。

本研究证实了MTHFR基因多态性与脑卒中的相关性同样适用于唐山地区人群,为该区域基于该基因多态性对脑卒中影响这一事实以采取预防措施提供了一定的依据。本研究尚存在一些局限性：本研究所选取的样本仅来源于华北理工大学附属医院,尽管样本量符合要求和样本数据符合Hardy-Weinbrey定律,但是期待本地区更多医院的样本,使得研究结果更具有代表性。与此同时,在研究的过程中发现,MTHFR基因多态性对脑卒中的影响,可能涉及除此以外的多种基因的联合效应,此种联合效应及相关基因与信号通路正在研究。有研究表明,联合基因型 FVL/MTHFR谱会增加第2次脑卒中发作的风险〔21〕。亦有研究表明,基因、蛋白质和环境线索都会产生累积效应,增加脑血管意外风险〔22〕。本研究尚未排除别的基因的影响及多种基因的联合效应,不可避免地导致研究误差,这一点上值得进一步深入研究。

综上所述,基于唐山地区人群的分析表明,MTHFR基因rs1801133 位点多态性与脑卒中发生有相关性,T等位基因携带者、杂合 CT 型、突变 TT 型可增加脑卒中风险,建议对上述基因型的患者及早采取预防措施。