紫色姜总黄酮提取工艺优化及其抗氧化作用研究

段志航，赵彩云，代博，唐达，李晓花*

滇西应用技术大学傣医药学院（云南 666100）

紫色姜为姜科姜属植物紫色姜（Zingiber montanum（J.Koenig）Link ex A.Dietr.）的干燥根茎，主要产自中国云南西双版纳，广泛栽种于傣族居民的房前屋后，是傣族常用调料品，傣药名“补累”，是傣药成药，国药准字Z20026657，双姜胃痛丸（帕中补）的主要药材，收录于《云南省中药材标准》（2005年版）[1-2]。现代对紫色姜的研究主要集中于挥发油，具有健胃、消食、散寒、止呕等功效[2-4]。黄酮类化合物是姜科姜属植物黄姜、大高良姜、山姜、干姜、良姜、大肉姜的主要活性成分，具有抑菌、抗炎、抗银屑病、抗氧化、减肥、降血脂、降血糖及防治糖尿病等多种活性[4-13]，被广泛用于食品、医药等领域。试验为进一步拓展紫色姜的开发利用前景，以其干燥根茎为原料，采用单因素试验为基础，以响应面法对紫色姜总黄酮成分的提取工艺进行优化，以DPPH·和·OH清除率为指标，评价其抗氧化能力[18-21]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫色姜干品（生产批号为滇20182806，西双版纳药业有限责任公司）；芦丁标准品（纯度＞98%，solarbio）；无水乙醇（分析纯，天津大茂化学试剂厂）；5%亚硝酸钠、10%硝酸铝、氢氧化钠（分析纯，美国默克Sigma-Aldrich试剂）；石油醚[分析纯，阿拉丁试剂（上海）有限公司]；1, 1-二苯基-2-苦基肼（DPPH，≥98%，北京索莱宝科技有限公司）；维生素C（≥99.7%，阿达玛斯试剂有限公司）；K2HPO4和KH2PO4（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司）；邻菲罗啉（分析纯、阿达玛斯试剂有限公司）；硫酸亚铁（分析纯、美国Amresco公司）；超纯水为自制。

1.2 主要仪器与设备

DHG-9070A型烘箱（上海一恒科技有限公司）；Secura125-ICN型分析天平（赛多利斯公司）；CR-031S型超声波清洗机（春霖清洗设备公司）；UV2600型紫外分光光度计（日本岛津有限公司）；UPR-Ⅱ-20L超纯水仪（郑州优尔普仪器）。

1.3 方法

参照《中国药典》（2020年版）附录Ⅳ及文献报道的高良姜等总黄酮的提取方法[10-13]，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法进行紫色姜总黄酮含量测定[9-11]。

1.3.1 对照品溶液的配制

将芦丁对照品干燥至恒重后，精密称取0.010 5 g，加适量85%乙醇超声溶解，放冷，定容至50 mL，摇匀，即得芦丁的对照品贮备试液（0.21 mg/mL）[12]。

1.3.2 标准曲线的绘制

精密量取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL对照品溶液，分别置于25 mL量瓶后加85%乙醇至6 mL。加0.8 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置10 min，加0.8 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，放置10 min，加4 mL 5%氢氧化钠溶液，定容，摇匀，静置20 min。以空白为扫描基线，从190～900 nm进行全波长扫描，最大吸收波长为365 nm。以空白开始，对不同浓度标准液在365 nm波长下测定吸光度，纵坐标为吸光度（A），横坐标为芦丁浓度（C），绘制标准曲线。标准曲线方程为y=0.014 7x-0.080 9，R2=0.999 8，线性关系良好[11-13]。

1.3.3 紫色姜总黄酮的提取和含量测定

紫色姜烘干，粉碎，过筛（60目，约0.250 mm），干燥保存。

称取1 g紫色姜粉末，加入30 mL石油醚浸泡脱脂提取8 h后，将药渣烘干，加入30倍67%乙醇，于30 ℃超声提取63 min，离心得上清液，用67%乙醇定容至50 mL，备用。

取1 mL备用提取液，加0.8 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置10 min，加0.8 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，放置10 min，加4 mL 5%氢氧化钠溶液，用相应体积分数的乙醇定容至50 mL，充分混匀，静置20 min，平行3份，以相应溶液为空白对照，在365 nm波长下测吸光度，根据芦丁标准曲线，计算待测液中紫色姜黄酮的浓度，按式（1）计算紫色姜中黄酮提取率（mg/g）[18-25]。

紫色姜黄酮提取率=c×a×V/M（1）式中：V为提取液体积，mL；c为提取液中黄酮质量浓度，mg/mL；a为稀释倍数；M为紫色姜质量，g。

1.3.4 紫色姜总黄酮提取单因素试验

紫色姜根茎经干燥、粉碎，脱脂提取后，称取1 g，在其他条件一致的情况下，分别考察单因素条件，包括不同功率、提取时间、料液比、乙醇体积分数对紫色姜总黄酮提取率的影响。提取液离心后定容，稀释，按1.3.2和1.3.3项下方法进行测定，每个试验平行3次试验，取平均值。根据试验结果设定响应面试验因素水平。

1.3.5 Box-Behnken 响应面试验

1.3.5.1 响应面法优化超声提取工艺

根据单因素试验结果，设定各因素水平，利用Design-Expert 10.0.3软件中Box-Behnken的中心组合试验设计原理，对单因素试验进行优化，考察时间、料液比、乙醇体积分数、超声功率对提取率的影响，以黄酮提取率为考察指标，设计四因素三水平的响应面试验（共29个试验点）进行正交试验，并进行方差分析，因素水平见表1[15-19]。

表1 因素水平表

1.3.5.2 提取工艺的验证根据Design-Expert 10.0.3软件运行结果，在超声功率、超声时间、料液比、乙醇体积分数等多因素共同影响下的最优提取工艺，结合实际工艺设置的可行性，采用优化工艺进行3次重复试验，将得到的实际提取率与理论提取率进行比较。若回归模型的预测值和实际试验结果相符合，则表明该回归模型可准确地预测和模拟紫色姜总黄酮提取率。

1.3.6 紫色姜总黄酮体外抗氧化活性研究

1.3.6.1 DPPH自由基清除活性

1.3.6.1.1 供试品溶液的制备

按1.3.3.1的优化工艺进行提取，得到提取液，进行稀释处理，得到0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mg/mL不同质量浓度的黄酮提取液。

1.3.6.1.2 DPPH溶液的制备

以95%乙醇溶液为溶剂配制浓度0.1 mmol/L的DPPH溶液。

1.3.6.1.3 VC对照品溶液的制备

精密称取0.5 g维生素C，用无水乙醇溶解、定容，于100 mL棕色容量瓶中，得到质量浓度5 mg/mL的阳性对照品溶液，避光冷藏于4 ℃冰箱中。取2，4，6，8，10和12 mL，用乙醇定容于100 mL，稀释配成0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mg/mL不同质量浓度的对照品溶液[18-19]。

1.3.6.1.4 DPPH自由基清除能力的测定

依次精密移取DPPH溶液、乙醇各2 mL，置于10 mL试管中，振摇充分混合，30 min后于波长517 nm处测定吸光度（Ac）；精密移取乙醇、供试品溶液各2 mL，置于10 mL试管中，振摇充分混合，30 min后，于波长517 nm处测定吸光度（Aj）；依次精密移取DPPH溶液、供试品各2 mL于10 mL试管中，充分混合振摇，静置30 min（室温下），于波长517 nm处测定吸光度（Ai）。平行测定3次以上，取平均值。按式（2）计算不同浓度紫色姜黄酮提取物对DPPH自由基清除率[18-19]。

式中：K为DPPH自由基的清除率，%；Ai为加试品、DPPH的吸光度；Aj为加试品的吸光度；Ac为加入乙醇、DPPH的吸光度。

1.3.6.2 紫色姜总黄酮羟基自由基清除能力测定

按1.3.3.1的优化工艺进行提取，得到提取液，进行稀释处理，得0.1 mg/mL黄酮溶液。取10个容量瓶（10 mL），分别加入0.1 mg/mL黄酮溶液与1，2，3，4，5，6，7，8，9和10 mL VC溶液，用乙醇溶液（65%）定容至10 mL，得到VC溶液和待测样品。取相同比色管（10个），分别加入2 mL pH 7.4，0.2 mol/L磷酸缓冲液和0.3 mL 2.5 mmol/L邻菲罗啉溶液，充分混匀。加入0.2 mL 7.5 mmol/L硫酸亚铁溶液，立即混匀，向其中分别加入1.5 mL VC溶液或紫色姜样品溶液，混匀，加入1 mL 1% H2O2。另做损伤管和未损伤管，其中损伤管中加入1% H2O2，未损伤管中不加1%H2O2，补充体积至8 mL，恒温1 h（37 ℃水浴），用紫外分光光度计在波长364.5 nm处测其吸光度。按式（3）计算清除率（%）。

式中：A2为样品管的吸光度；A0为未损伤管的吸光度；A1为损伤管的吸光度。

2 结果与分析

2.1 紫色姜总黄酮提取单因素试验结果

2.1.1 超声功率对紫色姜总黄酮提取率的影响

在温度30 ℃、料液比1∶30 g/mL、乙醇体积分数65%、超声时间60 min条件下，研究超声功率100，200，300，400和500 W时紫色姜总黄酮提取率，结果见图1。

图1 超声功率对紫色姜黄酮提取率的影响

由图1可知，在100～300 W功率范围内，紫色姜总黄酮提取率随着超声功率的增加而增加，最高提取率为30.94 mg/g。随着功率的进一步增加，紫色姜总黄酮的提取率降低，在500 W时总黄酮提取率下降至25.92 mg/g。这种现象可能是因为在适当范围内，提高功率，可以有效使细胞的内容物加速流出，从而增大提取液中紫色姜总黄酮物质流出。而超声功率过大，会导致空化泡的增长过大，进而降低空化作用和超声波的传播，减少能量的传递，这不利于提取的进行。

2.1.2 超声时间对紫色姜总黄酮提取率的影响

在温度30 ℃、料液比1∶30 g/mL、乙醇体积分数65%、超声功率300 W条件下，研究超声时间10，20，30，40，50，60，70和80 min时紫色姜总黄酮提取率，结果见图2。

图2 超声时间对紫色姜黄酮提取率的影响

由图2可知，在一定范围内，紫色姜总黄酮提取率随着时间的增加而增加，在60 min时紫色姜总黄酮提取功率最高（26.05 mg/g）。当提取时间延长至70 min时总黄酮提取率下降至25.12 mg/g。该现象可能是在一定范围内提取时间增加，有利于紫色姜总黄酮的溶出；但是随着提取时间的延长，超声破坏了黄酮类成分的结构，且其他物质溶出增加，使其得率下降。

2.1.3 料液比对紫色姜总黄酮提取率的影响

在温度30 ℃、乙醇体积分数65%、超声功率300 W、超声时间60 min条件下，研究料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL时紫色姜总黄酮提取率，结果见图3。

图3 料液比对紫色姜黄酮提取率的影响

由图3可知，在1∶10～1∶30 g/mL范围内紫色姜总黄酮提取率随着料液比中液体占比的增加，最高为32.88 mg/g。当料液比中液体占比进步一增加时，总黄酮提取率降低，在1∶50 g/mL时总黄酮提取率下降至28.05 mg/g，说明料液比中液体占比的增加导致其他化合物的溶出度增加，使其提取率下降。

2.1.4 乙醇体积分数对紫色姜总黄酮提取率的影响

在温度30 ℃、料液比1∶30 g/mL、超声功率300 W、超声时间60 min条件下，研究乙醇体积分数55%，65%，75%，85%和95%时紫色姜总黄酮提取率，结果见图4。

图4 乙醇体积分数对紫色姜黄酮提取率的影响

由图4 可知，紫色姜总黄酮提取率随着乙醇体积分数的增加呈现先升高后降低的趋势。在65%时紫色姜总黄酮提取功率最高（32.89 mg/g），在95%时总黄酮提取率下降至24.38 mg/g。说明乙醇体积分数增高可能导致其他化合物的溶出度增加，使总黄酮得率下降。

2.2 响应面法优化紫色姜总黄酮提取工艺

2.2.1 模型的建立与方差分析

在单因素试验基础上，以超声功率、超声时间、料液比、乙醇体积分数为影响因素，以紫色姜总黄酮提取率为响应值，采用Box-Behnken的中心组合试验设计原理设计模型试验，以Design-Expert 10.0.3软件对结果进行分析，确定紫色姜总黄酮的最优提取工艺条件，响应面试验设计及结果见表2，方差分析与显著性差异见表3。

表2 响应面试验结果及分析

表3 回归方程方差分析

如表3所示，对回归方程进行方差分析。其中，显著性检验概率P小于0.05时，认为该模型具有统计学意义。F值检验各变量，以评价对响应值影响的显著性的大小；F值越大，则相应变量的显著程度越大。从表3可以看出，工艺条件对提取率影响大小顺序为D＞A＞B＞C，即超声功率＞乙醇体积分数＞超声时间＞料液比。模型的决定系数R2为0.989 2，说明模型具有较高显著性，同时=0.978 5，能够解释试验97.85%的响应值变异，且与预测相关系数也接近，说明试验模型与真实数据有较好拟合度，可用该模型分析和预测提取率最佳的处理工艺。

应用Design-Expert 10.0.3软件对试验结果进行多元回归拟合，得到紫色姜总黄酮得率（Y）对乙醇体积分数（A）、超声时间（B）、料液比（C）、超声功率（D）的二次多元回归方程：Y=31.864+1.192 5A+0.8B-0.643 333C+1.689 17D+0.11AB+1.727 5AC-0.33AD+0.965BC+0.215BD+0.137 5CD-2.586 58A2-1.672 83B2-2.072 83C2-2.829 08D2。

不同工艺条件交互作用对提取率的影响见图5～图10。由图5可知，乙醇体积分数-超声时间交互作用，对提取率的影响趋势为一抛物曲面，乙醇体积分数和超声时间的增加使提取率呈先增后减变化趋势。取适中条件，即乙醇体积分数60%～70%、超声时间60～65 min时，可显著提高产物提取率。由图6可知，交互曲面纵向跨度较大，且等高线呈现显著椭圆形，表明乙醇体积分数和料液比交互作用对提取率影响显著。乙醇体积分数和料液比的增加使提取率结果呈先增后减变化趋势。仅考虑二者影响下，提取率优化工艺条件集中于乙醇体积分数60%～70%、料液比1∶25～1∶35 g/mL水平区间组合。如图7所示，乙醇体积分数和超声功率增加使提取率均呈先增后减变化。其中，提取率随超声功率的变化趋势更加显著，表明超声功率对提取率的影响较乙醇体积分数影响显著。乙醇体积分数65%～70%、超声功率300～350 W水平范围取值时，为二者交互影响下提取率的优化工艺。由图8可知：超声时间小于60 min时，提取率与超声时间呈正相关关系；超声时间大于60 min时，其关系发生转折，在超声时间60 min附近取值时，为提取率的临界最佳工艺参数。同理，提取率随料液比变化，其在1∶30 g/mL附近取值时，为临界最佳参数。如图9所示，超声功率和超声时间交互作用中，超声功率对提取率的贡献更大，是提取率的敏感影响因子。取超声功率300～350 W、超声时间水平60～65 min条件，利于促进产物提取率提升。如图10所示，提取率被超声功率的影响，较料液比影响更加显著，引起先增后减小的较大幅度曲面变化，取料液比1∶25～1∶30 g/mL、超声功率300～400 W水平附近值，可显著提高提取率水平。根据结果进行分析各影响因素，得出最佳提取工艺条件：超声功率330 W、超声时间63 min、料液比1∶30 g/mL、乙醇体积分数67%。

图5 超声时间与乙醇体积分数的响应曲面及等高线图

图6 料液比与乙醇体积分数的响应曲面及等高线图

图7 超声功率与乙醇体积分数的响应曲面及等高线图

图8 超声时间与料液比的响应曲面及等高线图

图9 超声时间与超声功率的响应曲面及等高线图

图10 料液比与超声功率的响应曲面及等高线图

图11 最佳超声提取工艺条件试验验证图

2.2.2 最佳超声提取工艺条件试验验证

为验证拟合的回归方程是否能指导实践生产，进行3次平行试验，取平均值，根据实际生产条件，调整最佳工艺参数：超声功率330 W、超声时间63 min、料液比1∶30 g/mL、乙醇体积分数67%，在此条件下，紫色姜总黄酮平均提取率为33.20 mg/g，与理论值相似，而且重复性较好。

2.2.3 抗氧化性研究

紫色姜总黄酮表现出的DPPH清除活性随着浓度的增加而增加[18-19]。从图12可以看出，质量浓度范围在0.1～0.6 mg/mL时，紫色姜总黄酮最大清除活性为46.33%。从图13可以看出，随着提取物浓度的升高，其对·OH自由基的清除率逐渐升高，具有浓度依赖性。此外，随着浓度的增加，紫色姜总黄酮质量浓度0.6 mg/mL时抑制率最高到54.20%。

图12 DPPH自由基清除试验

图13 羟基自由基试验

试验选择2种抗氧化活性评价方法，均表现出紫色姜总黄酮和VC的体外抗氧化能力，且抗氧化活性与紫色姜总黄酮浓度的增加密切相关。

3 结论

以紫色姜总黄酮为试验对象，单因素试验为基础，通过响应面优化法，优化辅助紫色姜总黄酮的提取工艺，考察超声功率、超声时间、料液比、乙醇体积分数对紫色姜总黄酮得率的影响。结果显示：响应面分析的二次模型，拟合程度较高，影响紫色姜总黄酮得率的因素主次顺序是超声功率＞乙醇体积分数＞超声时间＞料液比；提取的最佳工艺为超声功率330 W、超声时间63 min、料液比1∶30 g/mL、乙醇体积分数67%，紫色姜总黄酮提取率为33.20%，与理论值相差不大。采用·OH自由基和DPPH·清除试验对紫色姜总黄酮抗氧化活性进行体外抗氧化评价。试验结果显示，紫色姜总黄酮对不同自由基的清除能力不同，在质量浓度范围（0.1～0.6 mg/mL）内，紫色姜总黄酮均呈现剂量依赖的关系。虽然在·OH自由基和DPPH· 自由基清除试验中发现抗氧化活性均较VC弱，但在一定范围下，紫色姜总黄酮在抗羟自由基试验中显示出较好的抗氧化性，说明其具有抑制自由基生成的作用，可作为自由基清除型抗氧剂应用。