乳酸菌发酵花茶的制备工艺优化及其抗氧化活性研究

祝曼丽，郑真姐，魏琳芽，刘娇，许云贺，张莉力*

锦州医科大学食品与健康学院（锦州 12100）

玫瑰花富含黄酮、总酚、氨基酸、微量元素、挥发油、多糖等活性成分[1]，具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤、镇静安神等功效，被广泛应用在食品、药品、保健品等领域[2-5]。洛神花又名玫瑰茄，洛神花中含有黄酮、总酚、有机酸等活性成分，具有显著的抗氧化、抗肿瘤等作用[6]，被广泛应用茶剂、冷热饮料、果汁、果酱等方面[7]。蚕豆花中含有槲皮素和山奈酚，有良好的抗氧化活性，临床上从蚕豆花中提取左旋多巴治疗帕金森[8]，具有良好的降血压活性[9]。近几年，人们对花茶的需求量显著增加，花茶相关的产品开发和利用还处于初级阶段，产品较单一[10]。

目前，很多人把眼光放在了乳酸菌发酵植物基质上[11]。植物基质发酵可以改善风味，有助于提高抗氧化能力。苹果汁经乳酸杆菌发酵后抗氧化性有了明显的提高，乳酸菌发酵植物基质可以提高酚类化合物生物利用[12]，玫瑰干花瓣用乳酸菌发酵后抗氧化能力显著增强[13]。经过乳酸菌发酵后的玫瑰花抗氧化能力显著增加[14]。

因此，以玫瑰花、洛神花和蚕豆花为主要原料，以Liquorilactobacillus sataumensisML30和Lactococcus lactis subsp lactisYM34为发酵剂，以模糊评价为指标，利用单因素试验和响应面试验优化乳酸菌发酵花茶的最佳发酵工艺优化，并测定发酵过程中黄酮含量、总酚含量、DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力和羟自由基清除能力对其在发酵过程中的抗氧化能力并进行评价，为乳酸菌发酵花茶产品的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

玫瑰花（山东济南平阴县）；洛神花（安徽亳州沁园春堂）；蚕豆花（河北保定花辰月夕旗舰店）；黄冰糖（南京甘汁园糖业有限公司）。

研究初步设定玫瑰花和洛神花的比例3∶2、添加量3%、蚕豆花添加量0.02%、黄冰糖添加量8%、菌株比例1∶1、初始pH 5.2、发酵温度30 ℃、培养时间24 h。

L.satsumensisML30、L.lactis subsp lactisYM34发酵剂（菌保藏于锦州医科大学微生物实验室）；L.satsumensisML30种子培养基（红糖添加量6%、大豆低聚肽添加量0.3%、胡萝卜汁添加量7%、磷酸氢二钾的添加量0.2%、发酵温度30 ℃、初始pH 6、菌株接种量5%、发酵时间为16～18 h）；L.lactis subsp lactisYM34种子培养基参考李源等[15]。

1.2 主要仪器与设备

SG-C20 K36电磁炉（中山市森高电器有限公司）；DHP-9082恒温培养箱（苏州佳宝净化工程设备有限公司）；JB-VS-1300超净工作台（金坛市鑫鑫实验仪器厂）；PHS-3B精密pH计（上海雷磁仪器厂）；紫外分光光度计（上海沪净医疗器械有限公司）；LX-B100L立式自动压力蒸汽灭菌器（合肥华泰医疗设备有限公司）。

1.3 试验条件

1.3.1 花茶制备

按玫瑰花和洛神花的比例3∶2、添加量3%，蚕豆花0.02%放入到水中煮制沸腾，将洛神花挑出放入榨汁机中并加入适量水打碎5 s，过0.125 mm筛子和8层纱布。加入8%黄冰糖在70 ℃下加热溶解，搅拌均匀，花茶冷却至室温，用磷酸氢二钾调节pH，分装，在95 ℃下灭菌10 min。

1.3.2 单因素试验

以制备100 mL的花茶为标准，以模糊评定法[16]为评价指标，模糊评定法中感官评分占60%，菌体密度占40%，所有权数之和为1。权重系数矩阵M=（60%，40%）评价结果为V=MR，R为最大值，根据V的大小来综合判断花茶发酵程度。考察乳酸菌发酵花茶菌株接种量（2%，4%，6%，8%和10%）、菌株比例（YM34-ML30比例3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3）、初始pH（pH 4.5，5，5.5，6和6.5）、培养温度（20，25，30，35和40 ℃）、发酵时间（4，8，12，16和20 h）对乳酸菌发酵花茶品质的影响。

1.3.3 响应面试验

根据单因素试验结果，以模糊评定为指标，选出单因素中影响较大的因素，以发酵时间（A）、初始pH（B）、发酵温度（C）为自变量，以模糊评分（V）为响应值，进行工艺优化试验，因素与水平如表1所示。

表1 乳酸菌发酵花茶加工工艺响应面试验因素与水平

表2 感官评分表

1.3.4 感官评价

根据薛宝玲等[17]的感官评价方法，选择10名感官评价员（5男5女），以乳酸菌发酵花茶的外观、口感和香味等评价指标对产品进行感官评价，总分为100分。

1.3.5 吸光度的测定

吸光度采用紫外分光光度法[18]，以未发酵的花茶为空白，测菌体密度。

1.3.6 活性成分测定

最佳发酵条件优化的花茶，分别选取0，5，10和15 h四个时间段乳酸菌发酵的花茶，并测定最佳工艺下乳酸菌发酵花茶的黄酮和总酚含量。其中测定黄酮含量参照孙小晶等[19]的方法，标准曲线的方程为y=0.135 6x-0.044 4，R2=0.993 3，重复3次试验计算乳酸菌发酵花茶中的黄酮含量。总酚含量采用福林酚比色法[20]，标准曲线的方程为y=0.055 5x+0.000 7，R2=0.999 5，重复3次试验计算乳酸菌发酵花茶中的总酚含量。

1.3.7 抗氧化性测定

分别选取0，5，10和15 h四个时间段乳酸菌发酵的花茶，并测定DPPH自由基，参考Yang等[21]的检测方法；超氧自由基清除率的研究参考高善行等[22]的检测方法；羟自由基的清除率参考贾寒冰等[23]的检测方法。评价乳酸菌发酵花茶的抗氧化活性。

1.4 数据分析

数据统计利用SPSS 22.0版本对试验数据进行ANOVA单因素方差分析和LSD多重检验（P＜0.05），通过SNK检验法进行各组间的两两差异性比较。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 菌株接种量对乳酸菌发酵花茶的影响

菌株接种量为2%，4%，6%，8%和10%，分析菌株接种量对乳酸菌发酵花茶的影响。如表3所示，菌株接种量过大或过小对吸光度都有很大的影响，菌株接种量小于6%或大于6%时，乳酸菌发酵花茶的吸光度低于正常。当菌株接种量为6%时，乳酸菌发酵花茶的吸光度最高，结合感官评价后的V值也最高，此时得到的产品沉淀少，有一种玫瑰的淡淡清香味（P＜0.05），因此，较优的菌株接种量为6%。

表3 菌种接种量对乳酸菌发酵花茶的影响

2.1.2 菌株比例对乳酸菌发酵花茶的影响

菌株比例为3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3，分析菌株比例对乳酸菌发酵花茶的影响。如表4所示，菌株比例为1∶1时，乳酸菌发酵花茶中V值最高，吸光度最高为0.716±0.009，感官评价为79.5±0.47分，均高于其他比例（P＜0.05），在此情况下乳酸菌发酵花茶产品无沉淀，酸甜适中，说明在此菌株比例下，乳酸乳球菌和乳酸杆菌都能很好地生长，因此，选择菌株比例1∶1。

表4 菌种比例对乳酸菌发酵花茶的影响

2.1.3 初始pH对乳酸菌发酵花茶的影响

初始pH 4.5，5，5.5，6和6.5，分析初始pH对乳酸菌发酵花茶的影响。如表5所示，当pH为6时，乳酸菌发酵花茶中V值最高，得到的产品吸光度和感官评分好（P＜0.05），pH过低，乳酸乳球菌的生长会受到抑制，没有为乳酸乳球菌创造良好的生长环境，当初始pH过高时，乳酸杆菌的生长又会受到抑制，从而导致乳酸菌发酵花茶的风味不佳。因此，选择pH 6。

表5 不同pH对乳酸菌发酵花茶的影响

2.1.4 培养温度对乳酸菌发酵花茶的影响

培养温度为20，25，30，35和40 ℃，分析培养温度对乳酸菌发酵花茶的影响。如表6所示，温度对乳酸菌有较大影响，发酵的温度过低，菌体不能正常地生长繁殖，在此阶段菌体的代谢较慢，当发酵温度为30 ℃时，菌体的吸光度最高，但花茶的颜色较暗淡、略有苦味，V值不高，当发酵温度为35 ℃时，吸光度达到0.441，感官评价最高，颜色鲜艳、苦味不重、发酵风味良好，因此，培养温度选择35 ℃。

表6 发酵温度对乳酸菌发酵花茶的影响

2.1.5 发酵时间对乳酸菌发酵花茶的影响

发酵时间为4，8，12，16和20 h，分析发酵时间对乳酸菌发酵花茶的影响。如表7所示，发酵时间越长，吸光度越高，感官评价得分就越低，感官评价下降（P＜0.05），当发酵时间为16 h时，感官评价最高，发酵风味良好、质地均匀、颜色鲜艳且长时间不变色、酸甜适中，V值最高为0.952±0.003（P＜0.05），因此，选择发酵时间16 h进行后续试验。

表7 不同发酵时间对乳酸菌发酵花茶的影响

2.2 响应面试验优化乳酸菌发酵花茶发酵工艺结果

2.2.1 乳酸菌发酵花茶响应面试验结果

根据单因素试验结果，选择发酵时间（A）、初始pH（B）、培养温度（C）作为考察因素，依据模糊评定法确定V值，各因素试验设计与结果见表8。

表8 乳酸菌发酵花茶工艺优化响应面试验设计与结果

2.2.2 回归模型的建立

如表9所示，利用Design Expert 10.0软件对试验数据回归分析建立方程：V=0.95-0.039×A+0.032×B+0.037 5×C+0.085×A×B-0.028×A×C+0.040×B×C-0.079×A2-0.041×B2-0.089×C2。

表9 乳酸菌发酵花茶工艺优化回归模型方差分析

表10 乳酸菌发酵花茶抗氧化活性

响应面试验模型中的A、AB、A2、C2影响差异均极显著（P＜0.01），B、交互项BC对试验响应值影响显著（P＜0.05），C、交互项AC对响应值的影响不显著（P＞0.05）。由统计学模型可以得出，回归系数R2=0.958 5，模型校正决定系数Radj2=0.911 8，由此说明该模型可以解释91.11%响应值的变化，拟合度良好，误差小，可以用来分析乳酸菌发酵花茶的大众接受度，具有一定的指导意义。因变量与试验中所考察的自变量之间的线性关系显著，说明在此次对花茶发酵工艺条件优化试验中，试验数据误差较小，结果可信。它们之间的主次关系依次为发酵时间＞pH＞发酵温度。通过响应面优化分析，可得到花茶发酵的最佳发酵条件。根据Design-Expert 8.0.6.1软件求出回归模型极值点，结果表明最佳培养条件为发酵时间14.90 h、pH 5.7、发酵温度35.6 ℃，此时V值为0.952 6。为了方便乳酸菌发酵花茶的制作，将最优条件调整为发酵时间15 h、pH 5.7、发酵温度36 ℃。经过3次验证试验，V值为0.95，活菌数为3.6×108CFU/mL，发酵后的pH为3.8±0.05，这些指标说明该方程与实际情况拟合良好，适合应用于花茶发酵工艺条件的优化。

2.3 花茶发酵过程中活性成分和抗氧化能力分析

2.3.1 花茶发酵过程中活性成分的变化

花茶发酵过程中黄酮和总酚含量变化，结果如图1所示。黄酮和总酚含量随着发酵时间的延长而增加，总酚含量在发酵初始阶段（0～10 h）增加速度较缓慢，在10～15 h快速增加，在发酵结束时，总酚含量由最初的2.29±0.05 μg/mL增长至3.89±0.09 μg/mL，提高了69.76%，经过去糖基化反应使乳酸菌发酵花茶中有更多的糖基化酚，破坏植物的细胞壁，从而释放出更多的可溶性共轭或者不溶性酚类化合物，从而导致总酚含量增加[24]。在发酵0～5 h，黄酮含量增长得最快，由1.09±0.04 mg/mL增长至1.20±0.04 mg/mL，随着发酵时间的延长，黄酮的增长速度减缓，在发酵结束时黄酮增长至1.33±0.04 mg/mL，比发酵前提高了20.54%。酶经过酶解后会破坏细胞壁从而使黄酮更好地释放出来[25]。在发酵过程中，黄酮类和总酚类物质含量升高，是玫瑰花中的重要的活性生物成分，具有较强的生物活性，是一种天然的抗氧化剂[26]。

图1 花茶发酵过程中活性物质含量变化

2.3.2 发酵过程中抗氧化活性的变化

乳酸菌发酵后，花茶发酵的DPPH自由基清除率、超氧自由基清除率显著升高，分别上升了33.44%和6.13%，羟自由基清除率下降了6.63%。DPPH自由基清除能力增加表明微生物发酵可能会提高多酚化合物的可用性，说明乳酸菌发酵花茶具有一定的抗氧化活性。乳酸菌在发酵过程中产生酚类和黄酮类物质能使DPPH清除率的上升，使其抗氧性增强。研究也发现，总酚与清除超氧阴离子能力有显著的量效关系[27]。

3 结论

乳酸菌发酵花茶的最佳发酵工艺参数是菌株接种量6%、菌株比例1∶1、初始pH 5.5、培养温度36℃、发酵时间15 h。乳酸菌发酵花茶在发酵过程中，黄酮的含量提高了20.54%，多酚含量提高了69.76%，DPPH自由基清除能力提高了33.44%，超氧自由基清除率提高了6.13%，羟自由基清除率下降了6.63%。结果表明花茶经过乳酸菌发酵后抗氧化能力明显提高，为后续研究乳酸菌发酵花茶的营养成分奠定理论基础。