鼠李糖脂处理对早酥梨抗黑斑病的诱导作用及其机理

卢玉慧，谭芸秀，李永才，王小晶，毕 阳

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

早酥梨（Pyrus bretchneidericv.Zaosu）是我国西北地区主要栽培的一种早熟梨品种，因其果皮翠绿，果肉雪白、酥脆、多汁，从而深受消费者青睐[1]。但是由于早酥梨的采收季节正值夏季，环境温度的升高使得早酥梨果实极易受到病原菌的侵染，尤其是互隔交链孢菌（Alternaria alternata）引起的黑斑病作为早酥梨主要的采后病害，造成了严重的经济损失[2]。因此研发绿色安全采后病害控制方法已势在必行。诱导抗性是一种能够有效减轻果蔬采后病害的新方法，其通过生物或非生物方法激活果蔬自身的免疫能力，从而增强果蔬对病原物的抗性[3]。与传统杀菌剂相比，诱导抗性具有抗菌谱广、持续时间长、不会导致抗药菌株出现等特点。此外，诱导抗性会导致植物组织中酚类化合物的含量增加，提高果蔬的抗氧化性能[4]。

鼠李糖脂（rhamnolipids，RLS）作为生物源表面活性剂，研究认为其参与植物非特异性免疫，能诱导植物对多种病原真菌产生抗性[5]。RLS有双重作用模式：它们既有抗菌作用，又能刺激植物防御反应。Varnier等[6]研究发现RLS能诱导葡萄产生防御反应，质量浓度0.01 mg/mL RLS处理能使葡萄细胞几丁质酶基因表达量增加30 倍，RLS在质量浓度0.025 mg/mL下可强烈诱导几丁质酶基因的表达，相当于对照组（无PLS）的320 倍。源于铜绿假单胞菌的Rha-C10-C10和Rha-Rha-C10-C10以及来自植物芽孢杆菌的Rha-Rha-C14-C14在葡萄体内引发了强烈的防御反应，包括一些早期细胞信号传导，如钙离子内流、活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的激活，能激发钙离子内流、ROS的产生和MAPK的细胞信号传导[6]。同时RLS还诱导了致病相关的蛋白质基因和参与氧化磷脂和植物抗毒素生物合成途径的多种防御基因。RLS还能够刺激烟草、小麦和拟南芥的防御基因以抵御病原物的侵染[7]。

果蔬在采后贮藏过程中发生成熟和衰老，自由基不断积累，细胞膜受损，生理代谢紊乱，果蔬营养品质下降[8]。诱抗处理可以调节果蔬ROS代谢，减少有害自由基的积累，防止膜脂过氧化。诱导抗性涉及的典型机制主要包括氧化爆发、苯丙烷代谢激活。研究表明，属于水解酶类的病程相关蛋白几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶也属于防御产物，与植物系统的诱导性抗性密切相关[9-11]。苯丙烷途径是植物重要的次生代谢之一。由于苯丙烷途径可合成如酚类、木质素和黄酮大量的抗菌物质[12]。所以，苯丙烷代谢途径的激活被认为是果蔬产生抗性反应的标志之一。ROS的产生和它们被抗氧化防御系统清除之间的平衡决定了成熟和衰老的速度，从而决定了水果的保质期[13]。在果实成熟和衰老过程中，ROS的过量积累会导致氧化应激[14]。植物体内存在不同的酶系统来抵抗这种氧化应激[15]。在清除ROS的酶促系统中，过氧化氢酶（catalase，CAT）、过氧化物酶（peroxidase，POD）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）起关键作用。目前有关RLS对梨果采后病害的控制作用及其机理尚鲜见报道。因此本实验研究了RLS处理对黑斑病的控制作用及对早酥梨组织苯丙烷代谢、ROS代谢以及对病程相关蛋白的影响，以期为早酥梨采后病害的绿色防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试早酥梨采摘自甘肃省白银市景泰县条山农场，挑选无任何病虫害、机械损伤，且大小形状均匀的健康果实，去除田间热后，于4 ℃冷库中贮藏待用。

RLS（相对纯度≥95%）西安瑞捷生物科技有限公司；丙酮、硫代巴比妥酸、三氯乙酸 上海源叶生物科技有限公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP＋）试剂盒、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）试剂盒、H2O2试剂盒、试剂盒、还原型谷胱甘肽（reduced glutathione,GSH）试剂盒、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione,GSSG）试剂盒、几丁质酶试剂盒、β-1,3-葡聚糖酶试剂盒苏州科铭生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-2电热恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器公司；TGL-20M低温高速离心机 长沙平凡仪表有限公司；1510 型酶标仪 美国赛默飞世尔公司；UV-2450型紫外-可见光分光光度计 日本岛津公司；SPX-30085H-II型生化培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；A11 B S025研样机 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 RLS诱抗处理对早酥梨黑斑病的控制效果

早酥梨清洗后用体积分数1%次氯酸钠消毒2 min，再经蒸馏水冲洗，晾干，然后在质量浓度为10、20、30、40、50 mg/mL RLS溶液中浸泡20 min，室温下晾干。24 h后用无菌铁钉（直径3 mm）在果实赤道部位均匀地打3 个孔（深3 mm），待其晾干后接种1×106个/mL的A.alternata孢子悬浮液，待孢子悬浮液晾干。以无菌水处理作为对照。通过十字交叉法，每3 d测量一次果实的病斑直径，并记录数据，测量至第15天。每个处理用9 个梨果实，重复3 次。

1.3.2 生化指标测定取样

诱抗处理后，在诱抗后的0、7、14、21、28、35 d用灭菌手术刀取皮下2 mm左右的果肉组织，液氮迅速冷冻后用研样机研磨成粉末，于50 mL离心管保存待用，最后放置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.3 苯丙烷代谢相关酶活力及其代谢产物的测定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活力的测定参照Shang Qingmao等[16]的方法，单位以U/g表示。C4H活力的测定参照Zhou Fuhui等[17]的方法，单位以U/（min·g）表示。4CL活力的测定参照Knobloch等[18]的方法，单位以U/（min·g）表示。CAD活力的测定参照Li Hua等[19]的方法，单位以U/（min·g）表示。总酚含量的测定参照Scalbert等[20]的方法，结果以没食子酸当量表示，单位为mg/100 g。类黄酮含量的测定参照Cvek等[21]的方法，以儿茶素为标准物制作标准曲线来计算类黄酮含量，单位以mg/100 g表示。

1.3.4 ROS代谢相关指标的测定

细胞膜透率的测定参照Zhu Liqin等[22]的方法，用直径为10 mm打孔器取皮下2～5 mm处的果肉组织圆片3.0 g，去离子水冲洗3 遍后沥干水分，再放入含有40 mL去离子水的小烧杯中，放置3 h（25 ℃），记录起始电导率E0/（μS/cm）和终止电导率E1/（μS/cm）。最后将杯沸水浴加热（95 ℃、0.5 h），冷却到室温后测定其最终的电导率EZ/（μS/cm）。细胞膜透率计算如公式（1）所示。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）浓度的测定参照Sun Jiang等[23]的方法，在5 mL质量浓度100 g/L三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液中加入2 g组织粉末研磨，振荡混匀，冰浴浸提10 min后，4 ℃、8 000×g离心5 min后，取上清液2 mL，加入质量分数为0.67%硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）溶液2 mL，对照组以TCA溶液代替，混匀后再次沸水浴20 min，冷却至室温后，4 ℃、8 000×g离心5 min后，在450、532、600 nm波长处测定反应液的吸光度。MDA浓度计算如公式（2）所示。

H2O2含量及含量采用试剂盒进行测定。H2O2含量以μmol/g表示，含量以nmol/g表示。

NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）活力的测定参照Fluhr等[24]的方法；SOD、CAT活力的测定分别参照Bewley[25]和Gao Huijuan[26]等的方法；POD活力的测定参照Venisse等[27]的方法；APX活力的测定参照Bao Gaihong等[28]的方法；以上结果均以U/g表示。

采用试剂盒测定NADP＋、NADPH含量，结果以nmol/g表示。谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）活力的测定参照Cao Shifeng等[29]的方法，结果以nmol/（min·g）表示。单脱氢抗坏血酸还原酶（monodehydroascorbate reductase，MDHAR）活力的测定参照Wei Meilin等[30]的方法，结果以nmol/（min·g）表示。脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）活力的测定参照Yu Xiaozhang等[31]的方法，结果以nmol/（min·g）表示。采用试剂盒进行GSH、GSSG含量的测定，结果分别以μmol/g、nmol/g表示。

1.3.5 病程相关蛋白酶活力的测定

几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活力的测定采用试剂盒进行测定，结果以mg/（g·h）表示。

1.4 数据统计与分析

数据采用Microsoft Excel 2013软件计算，并用Origin 2017软件作图，用SPSS 26.0软件对得到的数据进行方差分析，采用Duncan’s多重差异显著分析。以上实验均重复3 次，且结果均以鲜质量计。

2 结果与分析

2.1 RLS诱抗处理对早酥梨黑斑病的控制效果

RLS诱抗处理显著抑制了早酥梨黑斑病的扩展，处理组与对照组之间差异明显，但各处理之间差异不明显（图1A）。在12 d后，质量浓度20 mg/mL的RLS处理组病斑直径显著低于质量浓度10 mg/mL处理组（P＜0.05），其病斑直径仅为对照组的64.29%，但与质量浓度30、40、50 mg/mL的处理组之间无显著差异（P＞0.05）（图1B），因此以质量浓度20 mg/mL的RLS处理研究其诱抗机理。同时由图1A可知，RLS处理的早酥梨果实的黄化程度明显低于对照组。

图1 RLS诱抗处理对早酥梨黑斑病扩展（A）及病斑直径（B）的影响Fig.1 Effect of RLS treatment on the development of black spot disease (A) and lesion diameter (B) in ‘Zaosu’ pears

2.2 RLS处理对梨果苯丙烷代谢的影响

2.2.1 RLS处理对梨果PAL、C4H、4CL和CAD活力的影响

PAL、C4H、4CL和CAD是果实组织苯丙烷代谢的关键酶。贮藏期间处理组和对照组梨果体内PAL活力呈先升高后降低的趋势，RLS处理后PAL活力较对照组显著提高（P＜0.05），第28天达到峰值后降低，RLS处理组早酥梨的PAL活力在第28天时比对照组提高了24.56%（P＜0.05）（图2A）。早酥梨果实的C4H活力呈单峰型变化，在第21天时RLS处理组C4H活力显著高于对照组（P＜0.05），其活力高出对照组10.66%（图2B）。梨果组织4CL活力整体呈现先上升后下降的趋势，在第28天达到峰值，且整个贮藏过程中处理组显著高于对照组（P＜0.05）（图2C）。CAD活力随贮藏时间的延长先增加后降低，在第28天达到峰值，此时RLS处理的早酥梨的CAD活力高出对照组20.73%（P＜0.05）（图2D）。

图2 RLS处理对贮藏期间早酥梨PAL（A）、C4H（B）、4CL（C）和CAD（D）活力的影响Fig.2 Effect of RLS treatment on the activities of PAL (A),C4H (B),4CL (C) and CAD (D) of ‘Zaosu’ pears during storage

总酚和类黄酮是苯丙烷代谢产物的主要产物。在贮藏期间果实的总酚含量总体呈上升的趋势，且RLS处理的梨果总酚含量均显著高于对照组（P＜0.05），在第28天，RLS处理的早酥梨的总酚含量高出对照组11.63%（P＜0.05）（图3A）。梨果类黄酮含量随贮藏时间的延长呈先上升后下降的趋势，在第28天达到峰值，此时RLS处理组早酥梨的类黄酮含量高出对照组7.98%（P＜0.05）（图3B）。

图3 RLS处理对贮藏期间早酥梨总酚（A）和类黄酮（B）含量的影响Fig.3 Effect of RLS treatment on the contents of total phenols (A) and total flavonoids (B) in ‘Zaosu’ pears during storage

2.3 RLS处理对梨果ROS代谢的影响

2.3.1 RLS处理对梨果NOX和SOD活力的影响

早酥梨的NOX、SOD活力在贮藏期间呈先上升后趋于平稳的趋势，RLS处理组的NOX活力在贮藏期间均显著高于对照组（P＜0.01、P＜0.05），在第14天达到峰值，此时处理组高出对照组15.52%（P＜0.01）（图4A）。除第28天外，处理组的SOD活力均显著高于对照组（P＜0.01、P＜0.05），在第7天差异极显著（P＜0.01），此时处理组高出对照组23.06%（图4B）。

图4 RLS处理对贮藏期间早酥梨NOX（A）、SOD（B）活力的影响Fig.4 Effect of RLS treatment on the activities of NOX (A) and SOD (B) in ‘Zaosu’ pears during storage

2.3.2 RLS处理对梨果H2O2和含量的影响

早酥梨果实的H2O2含量在贮藏期间呈单峰变化，RLS处理显著提高了梨果组织H2O2含量，在贮藏第21天时，RLS处理的早酥梨的H2O2含量极显著高出对照组54.79%（P＜0.01）（图5A）。早酥梨组织的含量呈先上升后下降的趋势，RLS处理提高了前期含量，后期处理组含量低于对照组（图5B）。

城中，枪声还在继续。木排上的战士们望着城中枪响的方向，心里说不出的悲伤。这时，一名战士发现躺在身边的夏国忠哼了一声，他转头看去，夏国忠嘴里涌出一股血，随即停止了呼吸。

图5 RLS处理对贮藏期间早酥梨H2O2含量（A）和含量（B）的影响Fig.5 Effect of RLS treatment on H2O2 content (A) and superoxide anion radical content (B) of ‘Zaosu’ pears during storage

2.3.3 RLS处理对梨果CAT和POD活力的影响

贮藏前期，RLS处理组和对照组果实的CAT活力随贮藏时间延长逐渐升高，贮藏第14天时，RLS处理组早酥梨的CAT活力高出对照20.83%（P＜0.05）（图6A）。POD活力呈单峰型变化，在第7天达到最大值，此时RLS处理组高出对照组39.63%（P＜0.01）（图6B）。

2.3.4 RLS处理对梨果APX、MDHAR、DHAR、GR活力的影响

APX 活力在诱抗处理期间先上升后降低，在第14天达到峰值，此时RLS处理梨果APX活力高出对照组27.59%（P＜0.01）（图7A）。MDHAR活力在贮藏前期迅速上升，后面趋于平稳，在第28天RLS处理组的MDHAR活力显著高出对照组9.50%（P＜0.05）（图7B）。DHAR的活力先上升后下降，在第21天达到峰值，此时RLS处理组高出对照组77.78%（P＜0.01）（图7C）。RLS处理和对照果实的GR活力随贮藏时间延长先升高后降低，与对照组相比，RLS处理提高了GR活力，在第21天达到峰值，其值高出对照组43.59%（P＜0.01）（图7D）。

图7 RLS处理对贮藏期间早酥梨APX（A）、MDHAR（B）、DHAR（C）和GR（D）活力的影响Fig.7 Effect of RLS treatment on the activities of APX (A),MDHAR (B),DHAR (C) and GR (D) in ‘Zaosu’ pears during storage

2.3.5 RLS处理对梨果GSH和GSSG含量的影响

RLS处理组和对照组果实的GSH含量随贮藏时间延长均呈上升趋势，RLS处理组GSH的含量显著高于对照组（P＜0.05、P＜0.01），在第35天，处理组的GSH含量高出对照组25.97%（P＜0.05）（图8A）。梨果组织的GSSG含量随贮藏时间的延长呈先上升后降低再趋于平稳的趋势，除第7、14天外，RLS处理组梨果GSSG含量低于对照组，在第21天达到峰值，此时RLS处理组GSSG含量低于对照组5.40%（P＜0.05）（图8B）。

图8 RLS处理对贮藏期间早酥梨GSH（A）、GSSG（B）含量的影响Fig.8 Effect of RLS treatment on GSH (A) and GSSG (B) contents in‘Zaosu’ pears during storage

2.3.6 RLS处理对梨果NADP＋和NADPH含量的影响

NADPH是NADP的还原态形式，在电子传递中也作为电子供体给出电子。贮藏期间，梨果NADP＋的含量呈先上升后下降的趋势，在第28天达到峰值，此时RLS处理的早酥梨的NADP＋含量高出对照组13.51%（P＜0.05）（图9A）。梨果组织NADPH的含量在贮藏前期上升明显，在第14天时达到峰值，后期趋于平稳。在第14天时，RLS处理组早酥梨NADPH含量高出对照组8%（P＜0.05）；在整个贮藏期间，RLS处理组果实的NADPH含量显著高于对照组果实（P＜0.05）（图9B）。

图9 RLS处理对贮藏期间早酥梨NADP＋（A）和NADPH（B）含量的影响Fig.9 Effect of the RLS treatment on NADP+ (A) and NADPH (B)contents in ‘Zaosu’ pears during storage

2.3.7 RLS处理对梨果MDA浓度和细胞膜透率的影响

细胞膜透率是评估膜渗透性的有效参数，它和MDA浓度可反映细胞膜完整性和脂质过氧化水平[32]。早酥梨贮藏期间组织的MDA浓度逐渐上升，RLS处理的早酥梨MDA浓度在贮藏第28天时低于对照组46.39%（P＜0.05）（图10A）。早酥梨细胞膜透率呈上升趋势，与对照组相比，RLS处理显著降低了细胞膜透率（图10B）。

图10 RLS处理对贮藏期间早酥梨MDA浓度（A）和细胞膜透率（B）的影响Fig.10 Effect of RLS treatment on MDA content (A) and cell membrane permeability (B) in ‘Zaosu’ pears during storage

2.4 RLS处理对梨果组织几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活力的影响

RLS处理的早酥梨果实中几丁质酶活性被显著诱导，在第7、21、28天RLS处理的早酥梨的几丁质酶活力分别高出对照组5.87%、3.51%和4.93%（P＜0.05）（图11A）。梨果组织β-1,3-葡聚糖酶活力随贮藏时间的延长先逐渐上升后下降，且RLS处理组显著高于对照组（P＜0.05），在第28天，RLS处理的早酥梨β-1,3-葡聚糖酶活力高出对照组14.87%（P＜0.05）（图11B）。

图11 RLS处理对贮藏期间早酥梨几丁质酶（A）和β-1,3-葡聚糖酶（B）活力的影响Fig.11 Effect of RLS treatment on chitinase (A) and β-1,3-glucanase (B)activity of ‘Zaosu’ pears during storage

3 讨论

苯丙烷的代谢是植物最重要的次生代谢途径之一，其在植物防御生物和非生物胁迫方面具有重要作用[33]。PAL、C4H、4CL和CAD是苯丙烷途径中的关键酶。苯丙烷途径由L-苯丙氨酸脱氨基生成肉桂酸启动，PAL是这一过程的关键调节酶[34]。PAL活力的增加与植物防御途径中活性代谢物的生物合成有关，例如木质素、酚类物质和类黄酮[35]。POD是木质素合成最后阶段的关键酶，催化单体木质素聚合成木质素，木质素交联细胞壁蛋白有助于巩固细胞结构。酚类化合物和黄酮类化合物是苯丙烷途径合成的主要产物。本研究表明，RLS处理诱导了PAL、C4H、4CL和CAD相关酶活力的提高（图2），同时促进了总酚、类黄酮的合成（图3），表明RLS可通过激活梨果组织的苯丙烷代谢而增强其抗病性。

几丁质酶与β-1,3-葡聚糖酶作为受不同胁迫刺激诱导的一组病程相关蛋白，在植物抵御病原限制和对环境的普遍适应中发挥着重要作用，病程相关蛋白可以提高整个植物对病原菌攻击的抵抗力，与植物的发育、抗病、逆境适应等特定机制密切相关[36]。病程相关蛋白是分子质量相对较低的多肽，其可在受感染的植物组织中积累，并显示出对蛋白质降解的高抗性，病程相关蛋白的积累是植物对病原菌最具特征的防御反应之一[37]。植物β-1,3-葡聚糖酶是一个高度复杂的大基因家族，参与病原菌防御和广泛的正常发育过程。底物几丁质和β-1,3-葡聚糖是各种真菌细胞壁的主要成分。已经证明几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶可以降解真菌细胞壁和细菌细胞壁[38-39]。本研究结果发现RLS诱导的早酥梨果实体内几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活力的增强和积累有助于提高对早酥梨黑斑病的抗性（图11），该结果与RLS防治西瓜枯萎病的研究结果相似，该研究发现将RLS（质量浓度1.0 g/L）喷施在西瓜叶片可使几丁质酶与β-1,3-葡聚糖酶活力分别提高49.95%和63.04%，从而预防西瓜枯萎病[40]。

果蔬组织中过多的H2O2积累会引起细胞膜脂质过氧化，从而加速细胞衰老和分解[41]。在本研究中，早酥梨在贮藏的前期和中期H2O2含量略有上升，在贮藏21 d，质量浓度20 mg/mL RLS处理的早酥梨的H2O2含量高出对照组54.79%（图5）。Nukuntornprakit等[42]研究发现过量的H2O2会对水果细胞造成损害。水果中的SOD、CAT、POD、GR和GSH是细胞清除这些ROS的主要保护酶和抗氧化剂[43]。这些保护酶增加了细胞膜通透性并减少了MDA的积累以实现自我抗氧化保护[44]。可见RLS处理可调节梨果组织的活性的产生和清除水平，有效维持组织的ROS水平，防止细胞免受伤害。

NADPH是一种重要的还原等价物，在细胞抵御氧化损伤方面必不可少。NADPH为ROS的分解提供还原能力，使其成为ROS防御过程中不可或缺的一部分，可促进植物体的生物合成。此外，还原型的NADPH在抗坏血酸-谷胱甘肽循环（ascorbate-glutathione cycle，ASA-GSH）循环中作为电子供体起重要作用[45]。NADP＋和NADPH参与生物体内的氧化还原反应是通过传递电子实现的，从而能够调节生物体内的各种代谢活动[46]。NADPH可参与清除各种胁迫下产生的自由基。因此RLS处理通过改变NADPH的含量从而影响细胞中ROS的产生和清除能力来保持细胞膜完整性以延缓果实衰老（图9）。

RLS对梨果抗病性具有显著的诱导作用，其中质量浓度20 mg/mL RLS处理显著抑制了早酥梨黑斑病的扩展，同时显著提高了梨果组织的PAL、C4H、4CL和CAD活力，以及总酚和类黄酮的含量，整体上显著诱导了几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活力，显著提高了NOX、SOD、CAT、POD活力及贮藏前期和中期H2O2和的含量，同时ROS清除系统AsA-GSH循环被激活，维持了梨果组织ROS动态平衡状态，进而降低了梨果细胞膜透率和MDA的含量。可见，采后RLS处理可通过调节梨果组织苯丙烷代谢、ROS代谢及病程相关蛋白进而增强其抗病性，其在果蔬采后病害控制中具有潜在的应用前景。