超高压及植物油添加量对兔肌球蛋白热凝胶特性的影响

崔旭海，白 云，徐幸莲，周怡汝，毕海丹,*，冯晓慧

（1.枣庄学院食品科学与制药工程学院，山东 枣庄 277160；2.南京农业大学食品科学技术学院，国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏 南京 210095）

肌球蛋白是肌原纤维中含量最丰富的蛋白质，约占肌肉蛋白质的1/4，是影响肌肉蛋白凝胶形成能力的主要组分，在肉类品质中发挥着重要作用[1]。高压已被证明会引起蛋白质结构的变化，从而改善肌肉蛋白质的凝胶特性[2]。高压处理作为一种非热处理技术，可用于改善食品中蛋白质的结构[3]，进而改变其食用和功能特性，因此受到了广泛关注。研究表明，不同水平的压力处理对肌肉蛋白热凝胶特性影响差异较大[4-6]。Xue Siwen等[7]的研究表明300 MPa的高压处理会使肌球蛋白过度变性；Iwasaki等[8]也发现200 MPa以上的高压处理会压缩肌球蛋白分子的体积，导致凝胶强度和表面弹性下降，其作用效果与压力和蛋白种类密切相关。绝大多数的报道均显示，适宜的高压处理可以增强肌球蛋白乳液的凝胶形成能力，显著改善畜禽肉类产品的保水性和质构特性等凝胶特性[9-12]。

蛋白质的热凝胶特性对于肉类食品最终质地和口感的形成影响很大，而植物油作为食品加工中重要的添加成分，同样对产品的质地和风味影响较大。研究表明，添加的油脂在热加工过程中能够稳定肉糜蛋白质凝胶网状结构，改善产品的质构特性和保水性，同时赋予产品良好的风味和口感[13]。对鱼糜的研究表明，添加外源油脂不仅能改善鱼糜制品的滋味和营养特性，而且脂质能通过与鱼糜蛋白的乳化作用进而改善鱼糜蛋白凝胶的功能特性[14]。目前，多数研究集中在探讨超高压条件[2,7,15]、食盐的添加[16-17]、磷酸盐的添加[12,17]等因素对肌原纤维蛋白或肌球蛋白凝胶特性[3-5]、理化性质[1-2]和相关功能性质[10,12]的影响方面；而关于超高压条件下油脂的添加对肌肉蛋白凝胶特性的影响鲜有研究，尤其是不同压力下结合油脂的添加对肌球蛋白热凝胶特性的影响规律尚未明晰。

本实验利用不同高压处理的兔肉肌球蛋白在非变性温度下添加不同体积分数植物油制备乳化体系，研究在后续升温过程中热凝胶特性与凝胶保水性的变化，确定较优的压力水平与植物油的添加水平，探讨其变化机理，以期为油脂在乳化型肉糜类制品中的使用及相关企业更好地利用超高压技术提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3 月龄健康新西兰雄性白兔（2.5～3.0 kg）江苏省农科院畜牧所；氯化钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、戊二醛（体积分数25%）、无水乙醇、叔丁醇等（均为分析纯）南京化学试剂有限公司；牛血清白蛋白、双缩脲 北京索莱宝科技有限公司；非转基因大豆油山东鲁花集团；聚乙烯真空包装袋（20 ℃下透氧率为1 cm3/（m2·h））北京华盾塑料有限公司。

1.2 仪器与设备

S-IL-100-850-9-W高压设备 英国Stansted Fluid Power公司；SIM-F124制冰机 日本三洋公司；FA1104B电子分析天平 上海越平科学仪器有限公司；Waring高速组织捣碎机 美国思伯明设备有限公司；Avanti J-E高速冷冻离心机 美国贝克曼有限公司；MCR 301流变仪 奥地利Physica公司；Spectra Max M2酶标仪 美国分子设备有限公司；TA-XT Plus型物性测试仪 英国Stable Micro Systems公司；MicroMR核磁共振分析仪 上海纽迈电子有限公司；S-3000N扫描电子显微镜 日本日立公司；Ultra Turrax T25高速匀浆器德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

参照钱畅等[12]的方法，选取健康的新西兰雄性白兔，宰前提供饮水和充分休息，减少应激。机械击昏后切断颈部血管放血，迅速剥皮，去头、爪及内脏，自来水冲洗去除血迹。沥干后放入冰箱（4 ℃），15 min后取腰大肌并剔除可见脂肪及结缔组织，切碎称质量[12]。肌球蛋白的提取具体参照Xue Siwen等[1]的操作方法在0～4 ℃下进行，用双缩脲法检测肌球蛋白质量浓度。最后用0.6 mol/L KCl（pH 6.5）缓冲溶液将蛋白质量浓度调至20 mg/mL，备用。

1.3.2 高压处理及不同油脂添加量下乳化体系的制备

将上述肌球蛋白溶液转移至真空包装袋中并密封（每袋约50 g，去除气泡），置于超高压腔体中，在压力100、150、200 MPa下保压2 min，腔体温度为10 ℃，以未进行高压处理（0.1 MPa）的肌球蛋白作为空白对照组。然后，分别取经高压处理和未经高压处理的肌球蛋白溶液50 mL（20 mg/mL）、不同体积的大豆油（分别为0、10、20、30 mL）、磷酸盐缓冲液（20 mmol/L，pH 6.5），三者共计100 mL，混合后利用高速匀浆器10 000 r/min匀浆2 min，制备好的乳化体系备用。其中，所制备的16 个样品体系具体如下：0.1 MPa处理组（油脂的体积分数分别为0%、10%、20%、30%）；100 MPa处理组（油脂的体积分数分别为0%、10%、20%、30%）；150 MPa处理组（油脂的体积分数分别为0%、10%、20%、30%）；200 MPa处理组（油脂的体积分数分别为0%、10%、20%、30%）。

1.3.3 肌球蛋白凝胶制备

参照钱畅等[12]的方法，将上述乳化体系置于玻璃小烧杯中，并在水浴锅中从20 ℃程序升温（1 ℃/min）至85 ℃，保温20 min，获得凝胶。再将凝胶置于0～4 ℃下过夜（12 h）。测定凝胶强度、保水性、水分分布并观察凝胶微观结构。

1.3.4 流变特性测定

参照Zhang Yulong等[18]的方法稍作改动，使用1.3.2节中制备好的肌球蛋白乳化体系作为样品。仪器采用平行板（上板直径50 mm），参数设置如下：频率为0.1 Hz，应变为1%，狭缝为0.5 mm，升温条件为20～85 ℃（2 ℃/min），记录储能模量G’（弹性特征）、损耗模量G”（黏性特征）的变化情况。

1.3.5 凝胶强度的测定

参照Chen Xing等[19]的方法并略做改动，利用质构分析仪进行凝胶强度的测定，单位为g。质构分析仪参数设定：测试前探头（P/5）下降速率2.0 mm/s，测试速率1.0 mm/s，测试后探头上升速率1.0 mm/s，穿刺测试距离5 mm，感应力3 g，用质构分析仪自带软件Texture Expert English 1.22进行分析，以穿刺曲线的第一个峰值即破断强度（g）表征凝胶强度。

1.3.6 保水性测定

参照Zhang Ziye等[20]的方法并作适当改动，通过离心失水率来表征保水性。准确称量上述制备的凝胶样品5 g左右置于离心管中，将离心管两两配平，经3 000×g（4 ℃）离心5 min后取出去除水分，准确称量余下样品质量，按下式计算离心损失率。

式中：m0为离心前空离心管的质量/g；m1为离心前离心管和凝胶的总质量/g；m2为离心除水之后离心管和凝胶的总质量/g。

1.3.7 核磁共振自旋-自旋弛豫时间（T2）测试

参照Han Minyi 等[9]的方法进行核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）测试，并略作改动。测试条件：质子共振频率为22.6 MHz，测试温度为32 ℃。取2 g凝胶样品放入核磁共振测试管再置于分析仪中。用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）序列进行测试。所使用τ值为350 μs，重复扫描32 次，间隔时间为7 000 ms，得到12 000 个回波峰点数。利用仪器自带的Multi Exp Inv Analysis软件进行反演，得到T2及对应的峰面积所占比例（P2）。

1.3.8 扫描电子显微镜观察

测试样品的制备参照徐幸莲[21]和钱畅[22]等的方法，首先用体积分数4%的戊二醛溶液进行固定，再用不同体积分数的乙醇溶液进行梯度脱水，然后放入叔丁醇中置换3 次，再将其冻干并用溅射镀膜机将制备好的试样进行喷金处理[22]。之后利用扫描电子显微镜选择放大1 000 倍进行观察。选取不同压力下未添加油脂和添加20%油脂样品的电子显微镜图片进行分析。

1.4 数据统计与分析

本实验凝胶强度、保水性、T2弛豫时间、P2峰面积百分数等指标均重复测定3 次，结果以平均值±标准差表示，流变特性取3 次重复的平均值进行作图。数据分析使用Statistix 8.1软件包中General Linear Models程序进行，对数据之间的显著性采用Tukey HSD法进行对比（以P＜0.05表示差异显著），采用Sigmaplot 12.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同高压处理后油脂的添加对凝胶流变学特性的影响

2.1.1 油脂添加量对凝胶G’的影响

由图1可知，油脂添加量对肌球蛋白乳液G’的影响程度不同，且呈现一定规律性。随着油脂添加量的增多，在所有压力条件下，G’都呈现出明显的增加趋势，即30%处理组＞20%处理组＞10%处理组＞0%处理组。与0%处理组相比，当温度在40～49 ℃时，随着油脂添加量的增加，各处理组G’的首个峰值温度均上升了2～4 ℃，说明油脂的添加以及超高压处理会使肌球蛋白头部的变性凝聚过程延后，这促进了该部分结构域的展开[12,23]，此时肌球蛋白和油脂会相互结合形成共聚物，G’开始增加。45 ℃左右时，肌球蛋白主体展开及分子间交联重组，造成G’下降。当温度达到53 ℃后，低聚物进一步聚集，涉及到尾部之间的交联，使得G’再次增加[24]，并在60～80 ℃明显增加，尤其是随着油脂添加量的增多这种现象更加明显，但在随后的升温过程中曲线逐渐趋于平缓，表明乳化凝胶结构在60～80 ℃区间快速形成，此结果与庄涛[25]的研究结果一致。由图1还发现，在相同油脂添加量条件下，G’整体表现为200 MPa处理组＞150 MPa处理组＞100 MPa处理组≈0.1 MPa处理组；油脂添加量为10%时，与未添加油脂的乳化体系相比，在0.1 MPa和100 MPa下升温过程中的G’略高于未添加组，但差异不大，而在150 MPa和200 MPa下升温过程中G’要明显高于未添加油脂的乳化体系。此外，油脂添加量为20%与30%时，所有高压处理组的凝胶黏弹性明显高于0%处理组，且150 MPa处理组对应差值达到最大，200 MPa次之。综上，适当的压力处理和油脂的添加可以提高乳化体系的弹性。这可能是因为随着油脂添加量的增加，一方面提高了肌球蛋白质溶胶的交联程度，促进了弹性结构的形成；另一方面，蛋白和油脂形成的乳化物相互作用力增强，进而提高了弹性特征[13,25]。

图1 不同压力处理下油脂的添加量对肌球蛋白热凝胶G’的影响Fig.1 Effect of soybean oil content on G’ of heat-induced myosin gels under different pressure levels

2.1.2 油脂添加量对凝胶G”的影响

由图2可知，不同油脂添加量对G”的影响程度也不同，其结果与G’类似。随着油脂添加量的增多，在所有压力条件下，G”都呈现出明显增加趋势，即30%处理组＞20%处理组＞10%处理组＞0%处理组；整体上每条曲线呈现先上升后下降的变化趋势。温度在40～49 ℃范围内，G”出现最大值，然后较快速下降，这是肌球蛋白质尾部展开造成临时的蛋白质网络结构被破坏所致[23-25]，当温度高于65 ℃时G”的变化逐渐趋于平缓，这是由于肌球蛋白质的头部易在此温度范围内发生结合聚集。在油脂添加量相同时，G”整体表现为150 MPa处理组＞200 MPa处理组＞100 MPa处理组≈0.1 MPa处理组；油脂添加量为10%时，与未添加油脂的乳化体系相比，不同压力下其升温过程中的G”略高，而油脂添加量为20%与30%时，所有高压处理组的凝胶G”明显高于0%处理组。150 MPa处理组油脂添加量为30%时G”最高值达到21.20 Pa，而200 MPa处理组G”最高值下降至19.91 Pa，表明若压力过高会导致乳化凝胶的黏性特征受到一定破坏，这与Xue Siwen[1,7]、Chen Xing[19]等的研究结果一致。综上，适当的压力处理和油脂的添加可以提高乳化体系的黏性，进而改善凝胶性能。此外，对比图1、2可以发现，在相同的油脂添加量下，G’明显高于G”，表明乳化体系加热过程中的弹性特征要显著高于黏性特征，这与文献[3,13]的研究结果相似。

2.2 不同高压处理后油脂的添加对凝胶强度的影响

由图3可知，不同压力下，随着油脂添加量的增加，肌球蛋白凝胶的破断强度与0%处理组相比均呈现显著增加的趋势（P＜0.05），但20%与30%处理组间差异不显著（P＞0.05）。油脂的加入可以增强与肌球蛋白分子之间的相互作用，促进凝胶网络结构的形成，一定程度提高凝胶强度[14]，本研究结果与庄涛[25]和Wu Mangang[26]等的研究结果一致。由图3也可观察到，在相同油脂添加量下，随着作用压力的增加，肌球蛋白凝胶的破断强度也都呈现增加的趋势，与0.1 MPa处理组相比，150 MPa和200 MPa处理组破断强度显著增加（P＜0.05），但两组间差异不显著（P＞0.05），油脂添加量为30%条件下，200 MPa处理组破断强度达到13.54 g，与0.1 MPa处理组相比增加了23.97%。上述结果同样说明，一定的高压处理可以适当提高肌球蛋白的凝胶强度，改善凝胶性能。

图3 不同压力处理下油脂的添加量对肌球蛋白凝胶破断强度的影响Fig.3 Effect of soybean oil content on breaking strength of heatinduced myosin gels under different pressure levels

有报道指出，超高压作用影响蛋白凝胶硬度的原因主要包括：诱导蛋白质的变性、通过二硫键的作用形成高分子质量多肽、形成三维网络凝胶结构[4-5]。Sikes等[27]利用高压处理低盐牛肉香肠，发现超高压可以促进蛋白质的溶解和部分蛋白质的伸展，进而改善低盐肉肠的质构特性。Zhang Ziye等[28]通过研究指出，较温和的压力水平可导致兔肌球蛋白中度变性和拉伸，破坏蛋白质结构，暴露更多的巯基和疏水基团，这些变化进一步导致聚集体和二硫键的形成，从而形成更强的蛋白质-蛋白质相互作用和更均匀的凝胶结构，进而提高凝胶的弹性和强度[4,28]；但较高的压力加剧了蛋白质的变性速率或解聚程度，减弱了蛋白质分子间的相互作用，导致肌原纤维蛋白交联度降低而不利于凝胶网络结构的形成，从而形成弱凝胶[4-5]。Alvarez等[29]的研究表明植物油能够增强蛋白质凝胶的网络结构，改善凝胶弹性。凝胶强度的增加是因为油脂填充了凝胶蛋白网络的空隙，限制了凝胶网状结构中蛋白质基质的移动，进而形成了更致密的凝胶网络结构[14,30]，此外，有研究表明，当油脂添加量增加时，有更多的蛋白能够参与凝胶结构形成，也会使凝胶强度增加[14]。

2.3 不同高压处理后油脂的添加对凝胶保水性的影响

由图4可知，在相同压力下，随着油脂添加量的增加，离心损失率呈现显著下降趋势（P＜0.05），凝胶保水性增强。当油脂添加量为10%时，随着压力的增加，离心损失率呈现显著下降趋势（P＜0.05），与未添加油脂组变化趋势相似；当油脂添加量为20%时，压力增加到200 MPa时离心损失率降低到最低值（45.21%）；当油脂添加量为30%时，随着压力的增加，150、200 MPa处理组与100 MPa处理组离心损失率差异显著（P＜0.05），150 MPa处理组和200 MPa处理组之间差异不显著（P＞0.05），但在200 MPa时离心损失率仍然最小（43.71%）。由以上结果可知，热凝胶的离心损失率不仅会受到油脂含量的严重影响，同样也会受到高压作用的影响，150 MPa与200 MPa处理组添加20%或30%油脂时离心损失率较小，保水性较好。Brewer等[31]研究发现，油脂含量越低，则蒸煮损失率越高，保水性和乳化稳定性越低[13]，适当地添加油脂会提高凝胶的保水性。这可能跟油脂与蛋白质的相互作用有关，当油脂含量在一定范围时，在适当压力下，脂肪微粒可以很好地分布于肌球蛋白中，肌球蛋白可以完全包裹脂肪微粒，形成稳定性较好的乳化物，提高保水性。Jiménez-Colmenero等[32]也发现，乳化橄榄油的添加可提高法兰克福香肠的乳化稳定性，这与本研究结果一致。

图4 不同压力处理下油脂的添加量对肌球蛋白热凝胶离心损失率的影响Fig.4 Effect of soybean oil content on centrifugal loss rate of heat-induced myosin gels under different pressure levels

2.4 不同高压处理后油脂的添加对凝胶微观结构的影响

如图5所示，当未添加油脂时，随着处理压力的增加，凝胶的网络更加致密，三维空间由疏松大孔结构逐渐转变为致密小孔结构，尤其在150 MPa和200 MPa时，表现为凝胶强度明显增加。如图6所示，当油脂添加量为20%时，油脂的添加形成了肉眼可见的片层状凝胶结构。结合图5进行比较分析，随着处理压力的增加，其结构更加致密、紧凑，形成了更加连续的凝胶基质，外在表现为凝胶强度和保水性增加，同样在150 MPa和200 MPa时，其表现更加明显。这可能是因为，经过一定高压处理后，肌球蛋白的粒度变小，进而在凝胶乳液中形成具有更加致密小孔的凝胶结构，所以表现为相对较高的凝胶强度[28]；当一定的油脂加入时，因为脂肪和蛋白质的相互作用，二者包合在一起，形成了更加紧凑的乳化微球结构，再通过加热作用进一步促使聚集的乳化微球结构形成最终致密而又紧实的片层状凝胶结构，此时凝胶强度最好。综上，适当的压力处理和油脂的添加可以显著改善肌球蛋白乳液热凝胶的质地特性，使凝胶基质的三维网络结构更加致密和紧凑，进而提高凝胶强度，而这种凝胶网络结构对于水分的保持又非常有利，所以同样有助于凝胶保水性的提高。这与前文凝胶强度与保水性的研究结果相印证。

图5 不同压力处理下未添加油脂的肌球蛋白热凝胶的扫描电子显微镜图Fig.5 Scanning electron microscopic images of heat-induced myosin gels without soybean oil addition under different pressure levels

图6 不同压力处理下添加20%油脂的肌球蛋白热凝胶的扫描电子显微镜图Fig.6 Scanning electron microscopic images of heat-induced myosin gels with 20% oil addition under different pressure levels

Boyer等[33]指出，三维凝胶网络是蛋白质-蛋白质之间、蛋白质-溶剂之间平衡的结果，在热诱导凝胶的形成过程中蛋白质分子侧链的快速反应能力会导致更大的分子间键形成。Hoogenkamp[34]发现，当用油脂对肉类蛋白进行预乳化时，会导致更多的盐溶性蛋白参与凝胶网络结构的形成，进而有助于凝胶强度的提高。而本研究中，适当的高压处理或油脂的添加会显著增加肌球蛋白分子参与更多的侧链反应，进一步提高蛋白和脂肪分子间化学键的相互作用，从而提高凝胶强度，改善保水性，这与前人的研究结果[1]一致。

2.5 不同高压处理后油脂的添加对凝胶水分分布的影响

低场核磁共振技术是一种快速、无损的检测手段，常用于测定样品中水质子的分布状态和移动性[35-36]，能够提供关于蛋白质固定水分子及其与氢质子相互作用的直接信息，从而反映肌球蛋白变性以及凝胶持水性的变化[9,13]。

由表1可知，热凝胶水分的分布在不同压力处理及不同油脂添加量下呈现不同的变化规律。T2b表示结合水，T21表示不易流动水，T22表示自由水，P2b表示结合水峰面积，P21表示不易流动水峰面积，P22表示自由水峰面积。油脂添加量为10%时，随着压力增加P22峰面积百分数降低，P21峰面积百分数增加，P2b峰面积百分数先上升后下降，T21弛豫时间整体上没有明显变化，T22弛豫时间先升高后降低，整体上随着处理压力的增加，水的流动性减弱，油脂的加入促进了肌球蛋白质的水合作用，利于保水[13]，这与前面离心损失率测定的结果相印证。油脂添加量为20%时，随着压力增加，T21弛豫时间先升高后降低，并在200 MPa时T21弛豫时间达到最小，且显著小于0.1 MPa处理组（P＜0.05）；T22弛豫时间也呈现先升高后降低趋势，但各处理组之间的T22弛豫时间差异不显著（P＞0.05）；P21峰面积百分数随着压力增加而增加，与0.1 MPa处理组相比，高压处理组均显著增加（P＜0.05），P22峰面积百分数随着压力增加而下降，与0.1 MPa处理相比，高压处理组均显著降低（P＜0.05），但高压处理组之间的差异不显著（P＞0.05），上述结果表明随着压力的增加，不易流动水的质子部分结合程度增加，使结合水含量增加，自由水的比例下降，更有利于凝胶网络的形成。油脂添加量为30%时，T21弛豫时间随着压力的增加达到110 ms左右后趋于稳定，不同压力处理组之间T22弛豫时间没有显著变化（P＞0.05），P21峰面积百分数与P22峰面积百分数的变化与添加20%油脂时相似，同样说明随着压力的增加自由水的比例减少。上述结果表明：适当的压力处理和油脂的添加会使原有的不易流动水与肌球蛋白结合更加紧密，促进自由水向不易流动水转变[9,13]，导致乳化物水合能力增强，并有利于增加保水性，这与前文保水性的研究结果相印证。

表1 不同压力处理下油脂的添加量对肌球蛋白热凝胶低场核磁弛豫特性（T2）的影响Table 1 Effect of soybean oil content on NMR relaxation properties (T2)of heat-induced myosin gels under different pressure levels

3 结论

压力和油脂添加量均会影响肌球蛋白热凝胶的G’、G”、凝胶强度等凝胶特性，并改变其热凝胶的微观结构，进而影响凝胶水分的分布，最终导致凝胶保水性的变化。总体上，所有高压处理组的G’、G”、凝胶强度、保水性等指标均明显高于未经高压处理组，在相同压力处理下，上述各指标表现为随着油脂添加量的增加而增大，即0%处理组＜10%处理组＜20%处理组＜30%处理组；在油脂添加量相同时（以20%为例），除G’和G”外上述各指标也都随着处理压力的增加而增大，即0.1 MPa处理组＜100 MPa处理组＜150 MPa处理组＜200 MPa处理组；扫描电子显微镜观察结果显示，在200 MPa条件下凝胶质地最佳；结合高压处理和油脂添加的影响，在200 MPa条件下添加30%油脂时，其凝胶强度、保水性均达到最大值，均显著高于0%处理组，同时具有较高的G’和G”，此时形成了致密少孔的片层状有序凝胶结构，凝胶质地和保水性最好。此外，低场核磁共振分析实验结果也表明适当的压力处理和油脂的添加能够促进乳化物水合能力的增强，并有利于保水性增加。

综上，高压处理结合油脂的添加对改善兔肌球蛋白热凝胶的功能特性起到了积极作用，尤其是在200 MPa条件下添加30%植物油时凝胶性能表现最好，但是更高压力下结合油脂处理对其热凝胶特性的影响仍需进一步探讨。