UPLC-MS/MS法测定酱香型白酒原辅料中非挥发性酚酸

骆茂香 刘磊 陈雯 陈仁远

摘 要：本文采用超高效液相色谱-质谱联用法（Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）同时测定酱香型白酒原辅料（高粱和大曲）中的5种非挥发性酚酸（原儿茶酸、对香豆酸、绿原酸、咖啡酸和阿魏酸）。结果显示，利用外标法建立的标准曲线线性关系较好，相关系数（R2）均高于0.995，精密度在0.6%～6.3%，回收率在94.2%～108.1%，准确度在-5.8%～8.1%。该方法操作简单、结果稳定性好、检测数据可靠，可用于酱香型白酒原辅料中非挥发性酚酸含量的测定。

关键词：超高效液相色谱-质谱联用法；非挥发性酚酸；酱香型白酒；高粱；大曲

Determination of Non-Volatile Phenolic Acids in Raw and Auxiliary Materials of Jiangxiangxing Baijiu by UPLC-MS/MS

LUO Maoxiang1， LIU Lei2， CHEN Wen2， CHEN Renyuan1*

（1.Guizhou Provincial Liquor Product Quality Inspectionand Testing Institute， Renhuai 564500， China; 2.Moutai Institute， Renhuai 564500， China）

Abstract： Five non-volatile phenolic acids （protocatechuic acid， p-coumaric acid， chlorogenic acid， caffeic acid and ferulic acid） in the raw materials and excipients of Jiangxiangxing Baijiu （sorghum and Daqu） were simultaneously determined by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry-mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. The results showed that the standard curve established using the external standard method had a good linear relationship， with correlation coefficients （R2） higher than 0.995， precision ranging from 0.6% to 6.3%， recovery ranging from 94.2% to 108.1%， and accuracy ranging from -5.8% to 8.1%. The method is simple， stable and reliable， and can be used to determine the content of nonvolatile phenolic acids in the raw and auxiliary materials of Jiangxiangxing Baijiu.

Keywords： ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry-mass spectrometry; non-volatile phenolic acids; Jiangxiangxing Baijiu; sorghum; Daqu

酚酸是酚類化合物，是食品中主要抗氧化物质的来源，其组成及含量对抗氧化活性起着决定性作用[1]。非挥发性酚酸包括原儿茶酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸等[2]。白酒酿造用原辅料如高粱、大曲中存在一些酚酸类物质，原辅料在各酶系、微生物的作用下也会生成一些酚酸，这些活性物质经过酿造、蒸馏等过程进入酒体，赋予白酒特殊的苦味和坚果香气，不仅影响白酒的风格和口感，增加白酒风味层次感，同时还具有抗氧化的作用[3-5]。有研究报道，酚酸对冠心病、糖尿病、高血脂、痛风等都有一定的预防作用[6-10]。阿魏酸是一种抗氧化剂，也是防癌物质，具有抗炎镇痛的功效[11]。因此，对白酒酿造原辅料中的酚酸进行定量有助于监控白酒的质量，提升白酒的品质。

目前，对酚酸进行检测的方法主要有薄层色谱法[12]、气相色谱-质谱联用法[13]、液相色谱-串联质谱法[14]等。酚酸类物质在酱香型白酒和其原辅料中含量较低，并且大多研究旨在检测白酒中酚酸的含量，对白酒原辅料中酚酸含量的研究较少。因此，本研究采用液相色谱-串联质谱法对白酒原辅料中的非挥发性酚酸进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

仁怀酱香型白酒核心产区所用大曲、高粱；原儿茶酸（99.0%）、对香豆酸（99.7%）、绿原酸（98.9%）、咖啡酸（99.7%）、阿魏酸（99.9%），阿尔塔公司；甲醇（色谱纯，德国默克公司）；磷酸（色谱纯，科密欧公司）；超纯水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 仪器与设备

漩涡振荡器（XH-B，江苏天翎公司）；台式电子天平（精确度0.000 1 g，赛多利斯公司）；0.44 μm滤头；离心机（TD4Z-WS，湖南湘立公司）；液相色谱质谱联用仪（Thermo Ultimate 3000，美国赛默飞世尔科技公司）；超纯水机（Milli-Q，Millipore公司）；电子天平（精度0.000 1 g，赛多利斯公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

粉碎高粱、大曲后分别过40目、20目筛，参照赵尚碧等[15]的样品预处理方法对样品前处理条件进行优化。分别称取5 g（精确至0.001 g）高粱或大曲粉末样品于50 mL离心管中，加入50%甲醇水溶液20 mL，振荡5 min后，以3 000 r·min-1离心30 min，吸取0.200 mL上清液于50 mL容量瓶中，加50%甲醇水溶液定容，经0.22 μm微孔滤膜过滤，待测。

1.3.2 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱：XDB-C18柱（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）；流动相A相为0.1%甲酸溶液，B相为甲醇，洗脱程序：0～15.00 min，5%→100% B，15.10～17.00 min，100% B，17.10～20.00 min，5% B；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流速：0.25 mL·min-1。

（2）质谱条件。电喷雾离子源（Electrospray Ionization，ESI），负离子模式；选择反应监测模式（Selected Reaction Monitoring，SRM）；毛细管温度：300 ℃；雾化气温度：320 ℃；鞘气压力：25 Arb；喷雾电压：3 500 V。5种酚酸的质谱分析参数见表1。

1.3.3 酚酸标准溶液的配制

标准溶液配制：分别取一定质量的5种酚酸标准品，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成一定浓度的标准储备液，在-20 ℃冷冻保存。用甲醇稀释标准储备液，配制5种酚酸混合标准工作液，现配现用。标准溶液配制浓度见表2。

1.3.4 数学模型

样品中酚酸含量的计算公式为

（1）

式中：C为待测组分的含量，g·kg-1；C测为由标准曲线得出的待测物的质量浓度，μg·L-1；m为所称取的样品质量，g；V为定容体积，mL。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

对原儿茶酸、对香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和绿原酸5种目标化合物标准工作溶液进行测定，并绘制标准曲线，结果如表3所示。原儿茶酸、对香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和绿原酸的标准曲线相关系数均大于0.995，相关系数满足《检测和校准实验室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《检测和校准实验室能力认可准则在化学检测领域的应用说明》（CNAS—CL01-A002：2020）等规范性技术文件规定的对于确认方法相关系数不应低于0.99的要求。

2.2 精密度实验

配制原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸和阿魏酸在高粱和大曲中3个浓度水平的样品添加溶液，分别进样6次计算精密度。由表4可知，5种酚酸在高粱、大曲中的精密度试验中变异系数为0.6%～6.3%，满足《检测和校准实验室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《检测和校准实验室能力认可准则在化学检测领域的应用说明》（CNAS—CL01-A002：2020）等规范性技术文件规定的精密度试验中变异系数小于7.5%的要求。

2.3 回收率及准确度实验

在空白样品中分别添加原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸标准溶液，在S1、S2、S5 3个浓度水平进行回收率和准确度试验，每个浓度水平添加3个平行样。由表5可知，在3个加标水平下，化合物的回收率在94.2%～108.1%，满足《检测和校准实验室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《检测和校准实验室能力认可准则在化学检测领域的应用说明》（CNAS—CL01-A002：2020）等规范性技术文件规定的回收率为90%～120%的要求。各样品化合物在S1、S2、S5 3个空白加标浓度水平的准确度偏差在-5.8%～8.1%，满足《检测和校准实验室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《检测和校准实验室能力认可准则在化学检测领域的应用说明》（CNAS-CL01-A002：2020）等规范性技术文件规定的准确度偏差在-20%～20%的要求。

2.4 实验样本测定

建立4种酚酸定性、定量方法后利用液相-串联质谱仪对样品进行检测。样品中原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸的含量范围如表6所示。

3 结论

采用超高效液相色谱-串联质谱法检测酱香型白酒原辅料（高粱和大曲）中的5种酚酸（原儿茶酸、对香豆酸、绿原酸、咖啡酸和阿魏酸）含量，方法操作简单、可靠，R2值、RSD、加标回收率、准确度等各项指标均达到分析要求，可用于酱香型白酒原辅料中酚酸含量的测定，有助于监控白酒的质量，提升白酒的品质。

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