响应面法优化米奶酒发酵条件研究

朱正军，缪佳成，徐 爽，夏 燕，沈 艳，汪江波，徐 健*

（1.湖北工业大学 生物工程与食品学院 工业发酵省部共建协同创新中心 湖北省工业微生物重点实验室 发酵工程教育部重点实验室，湖北 武汉 430068；2.湖北琪谱检测技术有限公司，湖北 武汉 430068；3.浙江兴业集团有限公司，浙江 舟山 316100）

奶酒是一种历史悠久的发酵酒，主要流行于我国的蒙古族地区以及东欧和中亚部分地区。传统奶酒，根据其所用发酵剂的形态、原料乳类型的不同可分为开菲尔（Kefir）和酸马奶（Koumiss）两大类[1]。奶酒传统上所用的原料一般是马奶，但由于马奶产量较低的问题，目前也有大量用羊奶和牛奶制成的奶酒[2]。研究发现，奶酒富含蛋白质、脂肪、乳糖、氨基酸、维生素和矿物质，还拥有预防心血管疾病、调节消化道活动、防止便秘、改善肾功能、降低血液胆固醇水平的功能[3]。由于这些有益的特点，奶酒如今在欧洲等地受到了越来越多的关注，然而，由于奶酒的风味特殊、酸度过高等特点，奶酒并不易被大众所接受，所以近来研究者们为了实现奶酒风味和品质的提升，尝试向奶酒中添加桃花、葡萄汁等辅料，开发了诸多新型的奶酒[4-5]。

米酒是我国传统的发酵饮料，其原料主要是糯米，通过蒸煮、接种米酒曲、糖化发酵等工序加工而成。米酒作为一种低酒精度饮料，因为其良好的风味深受我国消费者的喜爱[6]。米酒具有很高的营养保健功能，米酒中的蛋白质主要以多肽和氨基酸的形式存在，具有抗菌、保护肝肾功能、降低血压及血脂等功能，对人体生长发育也起着重要的作用[7]。米酒还含有大量有机酸，如乙酸、柠檬酸、琥珀酸等，这些有机酸在促进肠道消化吸收、缓解疲劳等保健功能方面有重大的意义[8]。除此之外，米酒中还含有丰富的维生素、无机盐、酚类物质、多肽、多糖和一些能够促进人体生长发育、预防疾病的微量元素[9-10]。米酒在乳制品中的应用由来已久，早在清朝时期，我国北方就有用糯米酒作为凝乳剂制作扣碗酪的传统，扣碗酪又称传统中式奶酪，这种奶酪口感爽嫩，兼具米酒的酒香和牛乳的奶香[11]。

本研究以糯米和脱脂奶粉为原料，研制出一款将奶酒与米酒特点结合在一起的新型发酵酒，与传统奶酒相比，其风味更加丰满协调，兼具奶香与米酒香且口感更加柔和，更加符合大众口味，与传统米酒相比，其蛋白质、维生素等营养物质更加丰富。通过单因素试验考察各因素对米奶酒品质的影响，另通过响应面优化其发酵条件，以期开发出一款口感丰富协调且兼具健康营养价值的新型发酵酒。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糯米（珍珠糯米，质量等级为一级）、脱脂奶粉：市售；乳酸菌发酵剂（含保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）、酿酒活性干酵母、甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；试验所用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

MJP-250恒温培养箱：上海精宏设备有限公司；SWCJ-IB（标准型）单人单面超净工作台：中国苏州智净净化设备有限公司；JJ6000电子天平：常熟市双杰测试仪器厂；DK-8D 恒温水浴锅：常州诺基仪器有限公司；YXQ-LS-75立式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实验有限公司医疗设备厂；PHS-3C pH计：上海雷磁仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米奶酒的制备流程及操作要点

糯米→蒸煮加曲发酵→米酒→稀释→加入脱脂奶粉→灭菌→接种→发酵→灭菌→冷却→成品

操作要点：

米酒的制备：挑选无霉烂糯米加水浸泡12 h后用清水洗净、沥水，常压蒸煮20 min，用清水冲淋冷却至米饭温度28～32 ℃。拌入糯米质量分数6‰的甜酒曲，搅拌均匀后于30 ℃发酵2 d。发酵完成后用纱布滤出酒液，并在室温条件下8 000 r/min离心5 min，取上清液85 ℃水浴20 min灭菌，4 ℃条件下保藏备用。

稀释、调配、灭菌：将米酒与水按一定体积比混合、稀释，并添加一定量的脱脂奶粉，搅拌至完全融化。在85 ℃水浴灭菌20 min，并迅速冷却至室温。

接种、发酵：将适量乳酸菌菌粉加入由脱脂奶粉制成的100 g/L液体脱脂乳培养基中，混匀后于37 ℃恒温培养箱中培养，待培养基凝固后再以50 g/L的接种量于另一液体脱脂乳培养基中，如此反复传代3～4次后，于4 ℃保藏备用；酵母菌活化：称取原料质量0.1%的活性干酵母溶于20 g/L的葡萄糖溶液中，38 ℃水浴20 min。将活化好的乳酸菌和酵母与冷却至室温的混合原料搅拌均匀，于30 ℃恒温条件下发酵2.5 d。

灭菌、冷却：发酵完成后38 ℃水浴20 min再次灭菌，冷却至室温即获得米奶酒成品。

1.3.2 米奶酒发酵条件优化单因素试验

以乳酸菌接种量6%，脱脂奶粉添加量7.5 g/100 mL，米酒添加量60%，发酵温度30 ℃，酵母菌接种量0.1%为基础条件，改变单一变量，分别考察不同乳酸菌接种量（2%、4%、6%、8%、10%），脱脂奶粉添加量（2.5 g/100 mL、5.0 g/100 mL、7.5g/100mL、10.0g/100mL、12.5g/100mL），米酒添加量（30%、40%、50%、60%、70%），发酵温度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）对米奶酒总酸、酒精度和感官评分的影响。

1.3.3 米奶酒发酵条件优化响应面试验

在单因素试验的基础上，选择脱脂奶粉添加量（A）、米酒添加量（B）和乳酸菌接种量（C）为3个影响因素，以米奶酒感官评分（Y）为响应值，设计3因素3水平响应面试验，响应面试验因素与水平见表1。

表1 米奶酒发酵条件优化Box-Behnken试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization of rice-milk wine

1.3.4 测定方法

酒精度：参考GB 5009.225—2023《酒和食用酒精中乙醇浓度的测定》的酒精计法测定[12]；总糖、总酸和氨基酸态氮：参考GB/T 23546—2009《奶酒》的方法进行[13]。

米奶酒的感官评价方法参照中华人民共和国国家标准GB/T 23546—2009《奶酒》中发酵型奶酒的评价细则，并结合米奶酒的酒体特点经过些许改动后进行，取约25 mL酒样于洁净干燥的品酒杯中进行评价。评定小组由10人（男女各5人）组成，且皆具有酒体感官评价经验。主要从色泽（10分）、气味（30分）、滋味（40分）、典型性（20分）四个方面依次对成品进行评分，总分为100分，米奶酒的感官评分标准见表2。

表2 米奶酒感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of rice-milk wine

1.3.5 数据处理

本研究中所有试验和检测均重复进行3次，数值以“平均值±标准差”表示。采用IBM SPSS 25.0版统计软件对数据进行显著性分析，P＜0.05认为数值间存在显著性差异。使用Origin 2021b软件进行数据绘图。使用Design Expert V13软件进行响应面试验设计和数据处理。

2 结果与分析

2.1 米奶酒发酵条件优化单因素试验

2.1.1 乳酸菌接种量对米奶酒发酵的影响

由图1可知，随着乳酸菌接种量的增加，米奶酒的总酸升高，酒精度降低，感官评分呈先升高后降低的趋势。乳酸菌接种量为8%时，米奶酒的感官评分最高，为82分。这可能是由于乳酸菌接种量的增大使得米奶酒发酵体系中乳酸菌活菌数上升，乳酸菌发酵过程中累积产酸量也不断增加[14]。而发酵体系总酸含量过高以及酵母菌和乳酸菌的生存竞争，可能会导致酵母的生长发酵受到抑制，从而使成品的酒精度下降。乳酸菌发酵过快、产酸过多也会对感官评分产生影响，总酸过高会使成品产生苦涩味，导致成品品质下降[15-16]。因此确定米奶酒乳酸菌最佳接种量为8%。

图1 乳酸菌接种量对米奶酒品质的影响Fig.1 Effect of Lactobacillus inoculum on the quality of rice-milk wine

2.1.2 米酒添加量对米奶酒发酵的影响

由图2可知，随着米酒添加量的增加，米奶酒的总酸略降低，酒精度及感官评分均呈先升高后降低的趋势。米酒添加量为60%时，米奶酒的感官评分最高，为81.5分。米酒中含有大量的糖，测得试验制备米酒总糖含量为413.1 g/L，酒精度为1.12%vol，这些糖是米奶酒中酵母发酵产乙醇的主要碳源[17]。当米酒添加量＞60%时，糖含量过高可能会抑制酵母菌的生长使得酒精度下降[18]。因此确定米奶酒中最佳米酒添加量为60%。

2.1.3 脱脂奶粉添加量对米奶酒发酵的影响

由图3可知，随着脱脂奶粉添加量的增加，米奶酒的总酸降低，酒精度无显著性变化，感官评分呈先升高后降低的趋势。脱脂奶粉添加量为7.5 g/100 mL时，米奶酒的感官评分最高，为80分。这可能是由于随着脱脂奶粉添加量的增加，发酵体系的水分活度降低，对乳酸菌的生长产生抑制作用，而酵母菌对低水分活度的耐受性较强，对其生长发酵影响较小[19]。当脱脂奶粉添加量较低时，米奶酒的感官评分也较低，这时米奶酒的奶味较淡且酸味过强。而当脱脂奶粉添加量过高时，酸味过低，口感单薄，且奶味掩盖了酒香，使得米奶酒整体风味不够协调。因此确定米奶酒中脱脂奶粉最佳添加量为7.5 g/100 mL。

图3 脱脂奶粉添加量对米奶酒品质的影响Fig.3 Effect of skim milk powder addition on the quality of rice-milk wine

2.1.4 发酵温度对米奶酒发酵的影响

由图4可知，随着发酵温度的升高，米奶酒的总酸升高，酒精度的变化不显著，感官评分呈先升高后降低的趋势。发酵温度为30 ℃时，米奶酒的感官评分最高，为81.2分。这可能是由于本试验所用的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的最适生长温度为40～45 ℃，温度越高越适宜嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的生长发酵，米奶酒的乳酸累积量也越高；发酵温度越低，米奶酒中乳酸菌的生长发酵速率就越慢，乳酸积累量越低。但温度过高又会加快酵母菌生长增殖，菌体过早进入衰亡期，不利于糖转化为酒精，使得米奶酒的酒精度有所下降[20-21]。发酵温度较低时乳酸菌发酵不充分，使得米奶酒酸味过低，感官评分下降。总酸过高时口感变涩，感官评分也降低。因此确定米奶酒的最佳发酵温度为30 ℃。

图4 发酵温度对米奶酒品质的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on the quality of rice-milk wine

2.2 米奶酒发酵条件优化响应面试验

米奶酒发酵条件优化响应面试验设计及结果见表3，方差分析见表4。

表3 米奶酒发酵条件优化响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface methodology for fermentation conditions optimization of rice-milk wine

表4Table 4 Variance analysis of regression model

使用Design-Expert V13软件对表3中数据进行多元二次回归拟合，得到以米奶酒感官评分（Y）为响应值，对脱脂奶粉添加量（A）、米酒添加量（B）和乳酸菌接种量（C）的多元二次回归方程模型：

由表4可知，失拟项P值0.235 0＞0.05，不显著，模型的F值为251.83，P值＜0.000 1，极显著，表明该模型的回归效果极显著，可用于对本试验中米奶酒的条件进行优化。同时根据P值和F值的大小可以判断各因素对米奶酒感官评分的影响大小[22]，一次项A、B，交互项AB、BC，二次项B2、C2对米奶酒的感官评分均有极显著影响（P＜0.01）。一次项C，二次项A2对米奶酒的感官评分均有显著影响（P＜0.05）。交互项AC对米奶酒的感官评分无显著影响（P＞0.05）。由F值可知，各因素对米奶酒感官评分影响顺序由大到小为：米酒添加量（B）＞脱脂奶粉添加量（A）＞乳酸菌接种量（C）。

2.3 各因素响应面交互作用分析

为更直观的分析各因素之间的交互作用对米奶酒感官评分的影响，根据表3和表4的结果使用Design Expert V13绘制三维图，结果见图5。

图5 各因素间交互作用对米奶酒感官评分影响的响应曲面与等高线Fig.5 Response surface plots and contour lines of the interaction of various factors on sensory score of rice-milk wine

由图5可知，响应曲面坡度越陡，其等高线也就越接近于一个椭圆，这说明这两个因素间对米奶酒的感官评分作用越显著，反之若等高线呈圆形则表示两因素交互作用不显著[23-25]。从图5A可以看出，脱脂奶粉添加量和米酒添加量的响应面图坡度最陡，等高线呈明显的椭圆形，这表明这两个因素的交互作用对米奶酒的感官评分的影响最显著，随着米酒添加量的增加，米奶酒的感官评分呈现先增长后逐渐减少的趋势，在米酒添加量为59%～67%时，米奶酒的感官评分较高。由图5B可知，脱脂奶粉添加量和乳酸菌接种量的响应面图坡度较缓，这表示这两个因素之间的交互作用对米奶酒的感官评分则没有显著的影响，而米酒添加量和乳酸菌接种量的等高线图（图5C）也呈一个椭圆，乳酸菌接种量固定不变，米奶酒的感官评分随米酒添加量的增加，呈现先增加后减少的趋势；米酒添加量不变，米奶酒的感官评分随乳酸菌接种量的增加先增大后明显减小，两因素对感官评分的影响呈显著正交互作用，上述三维图呈现结果与表4方差分析结果一致。

通过Design-Expert V13软件对数据进行分析后得到米奶酒的最佳发酵条件为：脱脂奶粉添加量8.92 g/100 mL、米酒添加量63.27%、乳酸菌接种量9.24%，此条件下米奶酒预测感官评分为81.8分。为了试验实际可操作性，将最佳条件参数调整为脱脂奶粉添加量9.0 g/100 mL、米酒添加量63.0%、乳酸菌接种量9.0%。按照调整后的条件进行验证试验，得到米奶酒感官评分实际值为82.3分，接近于预测值，证明模型拟合性好，表明结果有效。

2.4 产品质量指标

按照优化后条件制出的米奶酒感官评分为82.3分，呈乳白微黄，色泽均匀，有光泽。味道奶香浓郁，兼具米酒香和发酵乳香，口感上奶香与酒味协调，酸甜协调，酒体丰满，醇厚协调。由表5可知最佳条件下米奶酒酒精度为9.03%vol，总酸为5.07 g/L，总糖为82.10 g/L，氨基酸态氮为0.52 g/L，符合国标GB/T 23546—2009《奶酒》对发酵型奶酒的理化要求。

表5 奶酒标准及米奶酒质量指标Table 5 National standard for milk wine and quality indexes of rice-milk wine

3 结论

本研究以糯米和脱脂奶粉为原料，使用乳酸菌和酵母菌作为发酵剂进行米奶酒发酵。在单因素试验的基础上以感官评分为响应值进行响应面试验对米奶酒的条件进行优化，得到米奶酒的最佳发酵条件为：脱脂奶粉添加量为9.0 g/100 mL、米酒添加量63.0%、乳酸菌接种量9.0%。在此条件下发酵出的米奶酒感官评分为82.3分，风味丰满协调，兼具发酵乳香与米酒香，是一款口感细腻柔和且兼具健康营养价值的新型发酵酒，为我国米酒的加工应用和新型奶酒的研发提供了新的方向。