单一中药提取物对大肠杆菌和沙门氏菌的体外抑菌效果研究

2023-11-06赵钰涵冀红芹张文晶王忠顺孟令楠

现代畜牧兽医 2023年10期

赵钰涵，冀红芹，张文晶，王忠顺，孟令楠*

（ 1. 沈阳农业大学，辽宁沈阳 110000 ； 2. 辽宁农业职业技术学院，辽宁营口 115007 ）

中草药在畜牧业中的应用具有悠久的历史，早在两千多年前已有关于用中草药促进动物生长、增重和防治疾病的文字记载。近些年关于中草药体外抑菌的报道有很多，李美发等[1]使用黄芪、何首乌、黄连、金银花、大黄、白头翁、五倍子、葛根等8种中草药的提取液，对3种育肥猪常见的有害肠道菌株抑菌圈的大小和最小抑菌浓度（MIC）进行测定。结果显示，单一添加黄芪、黄连和大黄等3种中草药对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌体外抑菌效果较好。董晓龙等[2]取28 种中草药，研究其对4 种大肠杆菌菌株（血清型O78、血清型O41、血清型O24、血清型O1+O148）的体外抑菌效果，筛选出了秦皮、厚朴、黄芩、苦参、黄连、穿心莲、马齿苋、鱼腥草、白头翁和大青叶等10种对大肠杆菌抑菌效果较好的中药。随着禁抗政策的实施以及耐药菌株不断增加的发展趋势，中草药成为临床治疗畜禽疾病的新研究方向。本试验通过煎煮法和醇提法两种方式获得的中草药提取物研究其对鸡致病性大肠杆菌和沙门氏菌的体外抑菌效果，以期为中草药应用于畜禽细菌性疾病的临床防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种与培养基

试验所用大肠杆菌、沙门氏菌由辽宁省蛋鸡健康养殖重点实验室提供。

营养琼脂培养基、LB肉汤培养基常规配制。

1.1.2 试验药品鱼腥草、连翘、五倍子、紫花地丁、金银花、蒲公英、板蓝根、黄连均购自鲅鱼圈区新诚达药店。

1.1.3 试验仪器

电子分析天平、离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；无菌操作台（广州市康恒仪器有限公司）；恒温培养箱（上海幕斯实验设备有限公司）；高压蒸汽灭菌锅（合肥华泰医疗设备有限公司）；振荡培养箱（广州市康恒仪器有限公司）。

1.2 中草药提取液制备

1.2.1 煎煮法制备中草药提取液

本试验采取煎煮法进行制备中药提取液。使用电子天平分别称取中草药50 g，用清水清洗干净，在烧杯中加入500 mL蒸馏水浸泡2 h，分别放入砂锅中加热，大火煮沸后改为慢火煮30 min，纱布过滤后再将药渣使用同样的方法进行处理，重复两次，4 000 r/min离心10 min取上清液，浓缩后药液浓度为1 g/mL[3-4]。用试剂瓶装好并标记，高压灭菌后备用。

1.2.2 乙醇浸提法制备中草药提取液

称取中草药各50 g，粉碎，加5倍量95%乙醇，浸泡3 d后过滤，药渣再加5倍量95%乙醇浸泡3 d，过滤，合并两次滤液，55 ℃蒸馏回收乙醇，并使滤液浓缩至药液浓度为1 g/mL，在4 ℃的冰箱中保存[5]。

1.3 菌悬液的制备

将大肠杆菌与沙门氏菌分别划线接种于营养琼脂培养基，37 ℃恒温培养24 h 后，挑取单个活化菌落活，加入LB营养肉汤培养基中制成菌悬液，配置成1×106CFU/mL的菌悬液用于测定MIC及最小杀菌浓度（MBC）。

1.4 中药提取液的抑菌效果测定

开展单味中草药对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌及杀菌效果的研究，主要通过两种不同的提取方法（煎煮法和乙醇浸提法）获得中药提取物。获得中药提取物后采用琼脂平板打孔法进行大肠杆菌和沙门氏菌抑菌圈直径的测定[6-9]（大于20 mm 为极度敏感，15～20 mm 为高度敏感，10～15 mm为中度敏感，小于等于10 mm为低度敏感，“—”为无抑菌圈）以及MIC、MBC的测定[10-14]。

2 结果与分析

2.1 单味中草药对大肠杆菌的抑菌效果（见表1、表2）

表1 单味中草药提取液对大肠杆菌的抑菌效果（煎煮法）Tab.1 Antibacterial effect of single Chinese herbal medicine extract on Escherichia coli (decoction method)

表2 单味中草药提取液对大肠杆菌的抑菌效果（乙醇提取法）Tab.2 Antibacterial effect of single Chinese herbal medicine extract on Escherichia coli (ethanol extraction method)

由表1 可知，大肠杆菌对于8 种煎煮法提取的单味中草药表现出了不同的敏感性，其中大肠杆菌对于蒲公英提取物表现为极度敏感，抑菌圈的直径为22.27 mm；对五倍子提取物为高度敏感，抑菌圈的直径为16.25 mm；对鱼腥草、连翘、紫花地丁、金银花、板蓝根均表现为中度敏感，抑菌圈的直径分别为12.25、13.87、14.98、12.33、13.58 mm；对黄连提取物表现为低敏，抑菌圈的直径为8.24 mm。蒲公英提取物的MIC、MBC 分别为9.65 、15.66 g/L；五倍子提取物的MIC、MBC 分别为62.25、64.15 g/L；鱼腥草提取物的MIC、MBC分别为15.63、31.25 g/L；连翘提取物的MIC、MBC 分别为25.43、43.25 g/L；紫花地丁提取物的MIC、MBC 分别为250.00、250.00 g/L；金银花提取物的MIC、MBC 分别为250.00、250.00 g/L。板蓝根提取物的MIC、MBC 分别为250.00、250.00 g/L；黄连提取物的MIC、MBC分别为15.83、31.25 g/L。

由此可知，煎煮法所得的蒲公英提取物对大肠杆菌的抑菌和杀菌效果最强，其次是五倍子提取物，而鱼腥草、连翘、紫花地丁、金银花提取物对大肠杆菌的抑菌和杀菌效果相较前两种略微逊色，黄连提取物对大肠杆菌的抑菌效果较差。

由表2 可知，大肠杆菌对于乙醇提取法得到的五倍子提取物表现为极度敏感，抑菌圈的直径为23.60 mm；对鱼腥草为高度敏感，抑菌圈的直径为17.88 mm；对板蓝根、黄连提取物表现为中度敏感，抑菌圈的直径为14.68、12.66 mm；对连翘、紫花地丁、金银花、蒲公英均表现为低敏，抑菌圈的直径分别为9.10、8.55、7.55、6.41 mm。五倍子提取物的MIC、MBC 分别为17.66、33.16 g/L；鱼腥草提取物的MIC、MBC 分别为31.75、62.75 g/L；连翘提取物的MIC、MBC 分别为11.50、19.46 g/L；紫花地丁提取物的MIC、MBC 分别为500.00、500.00 g/L；金银花提取物的MIC、MBC 分别为500.00、500.00 g/L；蒲公英提取物的MIC、MBC分别为62.75、65.46 g/L；板蓝根提取物的MIC、MBC分别为31.75、62.25 g/L；黄连提取物的MIC、MBC分别为125.00、125.00 g/L。

综上所述，乙醇提取法所得的五倍子提取物对大肠杆菌的抑菌和杀菌效果最强，其次是鱼腥草提取物，之后是板蓝根和黄连提取物，而连翘、紫花地丁、金银花、蒲公英提取物对大肠杆菌的抑菌效果较差。

2.2 单味中草药对沙门氏菌的抑菌效果（见表3、表4）

表3 单味中草药提取物对沙门氏菌的抑菌效果（煎煮法）Tab.3 Antibacterial effect of single Chinese herbal medicine extract on Salmonella (decoction method)

表4 单味中草药提取物对沙门氏菌的抑菌效果（乙醇提取法）Tab.4 Antibacterial effect of single Chinese herbal medicine extract on Salmonella (ethanol extraction method)

由表3 可知，沙门氏菌对煎煮法提取的五倍子提取物表现为极度敏感，抑菌圈的直径为27.38 mm；对板蓝根提取物表现为中度敏感，抑菌圈的直径为13.46 mm；对鱼腥草、连翘、紫花地丁、金银花、蒲公英、黄连均表现为低敏，抑菌圈的直径分别为7.12、9.88、8.98、9.98、6.98、9.25 mm。五倍子提取物的MIC、MBC 分别为33.75、34.25 g/L；鱼腥草提取物的MIC、MBC 分别为31.25、31.30 g/L；连翘提取物的MIC、MBC 分别为250.00、250.00 g/L；紫花地丁提取物的MIC、MBC 分别为100.00、100.00 g/L；金银花提取物的MIC、MBC分别为500.00、500.00 g/L；板蓝根、蒲公英提取物则无杀菌作用；黄连提取物的MIC、MBC 分别为62.50、100.00 g/L。

综上，煎煮法所得的五倍子提取物对沙门氏菌的抑菌和杀菌效果最强，其次是板蓝根，而鱼腥草、连翘、紫花地丁、金银花、蒲公英等对沙门氏菌的抑制效果较差。

由表4 可知，沙门氏菌对于乙醇提取法得到的五倍子提取物表现为极度敏感，抑菌圈的直径为23.88 mm；对连翘、紫花地丁、板蓝根、黄连提取物为中度敏感，抑菌圈的直径为10.68、12.58、11.26、10.62 mm；对鱼腥草、金银花、蒲公英提取物为低敏，抑菌圈的直径为7.22、9.25、6.58 mm。五倍子提取物的MIC、MBC 分别为17.66、33.16 g/L；连翘提取物的MIC、MBC 分别为13.25、19.48 g/L；紫花地丁提取物的MIC、MBC 分别为500.00、500.00 g/L；板蓝根提取物的MIC、MBC 分别为33.24、64.75 g/L；黄连提取物的MIC、MBC 分别为100.00、100.00 g/L；鱼腥草提取物的MIC、MBC 分别为35.25、68.75 g/L；金银花提取物的MIC、MBC 分别为500.00、500.00 g/L；蒲公英提取物的MIC、MBC 分别为58.65、64.88 g/L。

由试验结果可知，乙醇提取法所得的五倍子提取物对沙门氏菌的抑菌和杀菌效果最强，其次是连翘、紫花地丁、板蓝根、黄连提取物，而鱼腥草、金银花、蒲公英提取物对沙门氏菌的抑菌和杀菌效果较差。

3 讨论

本试验结果显示，综合8 种中草药单味提取物对鸡致病性大肠杆菌的抑菌效果，煎煮法得到的单味中草药提取物中，蒲公英提取物对大肠杆菌抑菌效果最强，五倍子次之；醇提法得到的单味中草药提取物中，五倍子提取物对大肠杆菌最为敏感，鱼腥草次之，蒲公英则表现为低度敏感。同种中草药采取不同提取方式的提取液对同一菌种的抑菌效果不同，原因可能是不同提取方式和溶剂所提取出的抑菌有效成分不同。本研究结果和王雅如等[15]试验结果一致，究其原因可能与抑菌物质在溶剂中的溶解度、提取温度与时间有关。

本研究结果显示，8 种中草药单味提取物对沙门氏菌的抑菌效果中，煎煮法得到的五倍子提取物抑菌效果最好，其他中药敏感性均不高；醇提法得到的五倍子提取物依然敏感性最高，紫花地丁等单一中药呈中度敏感。综上所述，同一种中药采取相同的提取方法对不同病原菌的抑菌效果也不相同，这可能跟病原菌菌体结构、组成成分的有关，从而表现出抑菌效果的差异性。