戊型肝炎病毒基因3 型衣壳蛋白与Huh-7 细胞互作蛋白的筛选
2023-11-06宋阳冉连瑞雅陈轶霞李慧霞
梁 鹏,宋阳冉,连瑞雅,陈轶霞,李慧霞
( 1. 西北民族大学生物医学研究中心 生物工程与技术国家民委重点实验室,甘肃 兰州 730030 ; 2. 西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃 兰州 730030 )
HEV基因3型中ORF2蛋白参与调节病毒的复制和增殖、装配及与宿主蛋白互作,由于HEV的体外增殖困难且HEV 模式动物也是近年来的研究热点,因而发掘与ORF2互作的宿主蛋白指导动物模型的构建仍具有一定的科学意义。基于此,本研究利用免疫共沉淀和蛋白质谱分析技术,结合生物信息学分析,筛选与ORF2蛋白相互作用的宿主蛋白,为探索动物与宿主之间的靶蛋白与ORF2 的互作及其参与HEV感染提供兽医公共卫生的预警体系,实现动物HEV的常态跟踪和防控。
1 材料与方法
1.1 试剂与抗体
Not I 和Nhe I 两种限制性内切酶、高保真酶PrimeSTAR premix、T4-DNA连接酶和感受态细胞DH-5α均购自Takara公司;高敏ECL发光底物、5×转膜缓冲液膜购自Bio-rad 公司;Lipofectamine 3000 购自Invitrogen 公司;Myc-Tag Mouse mAb鼠单克隆抗体购自生工生物工程(上海)公司;GAPDH 鼠多单克隆抗体购自北京全式金生物技术股份有限公司;银染试剂盒购自碧云天生物技术有限公司;pCAGEN-myc空载、HEV Kernow C1/P6和Huh-7细胞均由生物工程与技术国家民委重点实验室保存。
1.2 试验方法
1.2.1 ORF2真核表达载体的构建与鉴定
以HEV Kernow C1/P6基因为模板,设计针对ORF2全长的特异性引物ORF2-F:5'-GTTGAGCAGAACCCGAAGAG-3'(下划线为Not I 酶切位点),ORF2-R:5'-CGGGCTCAGTCAAGTAAAGC-3'(下划线为Nhe I 酶切位点)。PCR 反应体系(50 μL):ORF2-F 1 μL、ORF2-R 1 μL、PrimeSTAR premix(2X) 25 μL、P6 质粒2 μL、DEPC水21 μL。
反应程序参照PrimeSTAR premix说明书推荐条件,利用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。限制性内切酶Not I和Nhe I 分别酶切pCAGEN-myc 空载和PCR 回收产物,37℃,7~8 h;将两种酶切产物分别回收后,利用T4 DNA Ligase进行连接反应:4 ℃、12 h;之后按照感受态使用说明书,将连接产物转化至DH-5α中,涂板至氨苄青霉素抗性细菌平板上,37 ℃、12~16 h;挑取单克隆菌落,依次进行菌液PCR鉴定和双酶切鉴定,阳性菌液送至北京擎科生物科技有限公司测序。
1.2.2 Huh-7细胞转染与表达鉴定
用10% FBS-DMEM 培养的Huh-7 细胞,经胰酶消化后,以4×105个细胞/孔铺至6 孔板中,待细胞密度生长至70%~80%,用Lip3000 转染ORF2 重组质粒(2 μg/孔),36~48 h 后离心收细胞,NP40 细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂PMSF),冰上裂解20 min,低温,12 000 g离心15 min,转移上清,加入5×Loading Buffer,煮样5 min,进行SDSPAGE 和Western blotting,Myc 标签抗体用于检测重组质粒是否正确表达。
1.2.3 免疫共沉淀分析
想要让学生的家长不担心学生的学习成绩,那么就需要教师能够先给学生安排合理的时间,要让学生学会合理地分配自己的业余时间,能够让学生学习足球技巧和学习理论知识两个都不耽误,并让学生在成绩稳定的情况下,和学生家长协商,适当参加足球活动,并让学生家长能正确地看待体育教学,了解体育教学的重要意义。还可以向学生家长介绍足球的价值,不仅能够锻炼身体,还能够培养学生之间的团结力,是学生发展“德、智、体、美、劳”方面的重要基础。
按上述操作方法进行细胞转染,收集Huh-7 细胞,获得细胞裂解上清;按照Protein G Agarose 使用说明书进行Co-IP 试验,取10μL Protein G Agarose,加入5 μL Myc-Tag Mouse mAb 抗体,室温孵育1 h;加细胞裂解液并充分混匀后,置于4 ℃翻转摇床孵育过夜;2 500 r/min 离心5 min,弃去上清,同样方法用PBS 洗涤5 次;最后加入20 μL PBS 和相应体积的Loading Buffer,制备蛋白样品。以上均设置一个空载体对照组,ORF2 转染设置3 个平行组(A、B和C)。
1.2.4 银染试验和蛋白质谱分析
参照银染试剂盒说明书进行银染试验,注意操作中一定要使用纯水或超纯水,以降低显色背景显色时间约为1~2 min,蛋白条带出现后快速加入终止液,以防过曝;显色后,切胶条,低温保存,送上海中科新生命生物科技有限公司,利用QE 质谱仪进行蛋白质谱分析,MASCOT 等质谱匹配软件分析蛋白数据。
1.2.5 生物信息学分析
基于蛋白质谱分析获得的蛋白数据,利用Venny2.1.0分析对照组与试验组的差异蛋白;将获得的靶蛋白输入STRING 蛋白质相互作用数据库,进一步筛选与ORF2 互作的靶蛋白,筛选条件设置为:最低相互作用得分为高可信度0.7 分,数据来源为试验验证。将获得蛋白序列号上传至STRING 数据库进行检索,使用R(4.2.1)版本获得网络内部的蛋白相互作用关系,综合以上信息并使用Cytoscape 3.5.0软件构建相互作用蛋白网络。
分别使用R软件(4.2.1)版本语言包中的ggplot2[3.3.6]和cluster Profiler,对靶蛋白进行GO分析和KEGG分析,显著性cut-off值一般设置为校正后P<0.05,对富集分析结果进行可视化分析。
2 结果与分析
2.1 pCAGEN-myc-ORF2 重组质粒的构建及其在Huh-7细胞中的表达鉴定(见图1)
图1 pCAGEN-myc-ORF2重组质粒的构建与表达鉴定Fig.1 Construction and expression identification of pCAGEN-myc-ORF2 recombinant plasmid
由图1(a)可知,利用HEV Kernow C1/P6 质粒为模板cDNA,通过PCR反应成功克隆出ORF2全长基因,与预期条带大小接近(1 983 bp),且无非特异性扩增条带。
由图1(b)、图1(c)可知,连接产物经转化挑菌后,菌液PCR鉴定发现,1、2、4、5均为阳性;提取质粒后的双酶切鉴定发现两个克隆酶切条带大小均合适,将两个阳性菌液测序后,将测序正确的阳性克隆命名为pCAGEN-Myc-ORF2。
由图1(d)可知,该质粒转染进Huh-7细胞后,Western blotting 鉴定发现pCAGEN-Myc-ORF2-1 成功表达,与预期条带大小一致(72 kD)。
2.2 ORF2互作蛋白的筛选(见图2、图3)
图2 免疫共沉淀产物银染分析Fig.2 Silver staining analysis of CO-IP products
图3 韦恩图分析Fig.3 Wayne diagram analysis
由图2可知,与对照组相比,试验组KerORF2-A、B、C等3 条泳道均有多条差异条带,并且3 个试验组条带基本一致。切胶进行蛋白质谱分析后,利用MASCOT 等质谱匹配软件分析蛋白数据,分析获得的不同组别的蛋白数据,将对照组和3个试验组(KerORF2-A、B、C)蛋白的序列号(Acession No.)输入Venny 2.1.0 中,经韦恩分析最终得到37个潜在的互作蛋白(见图3)。
2.3 生物信息学分析(见图4、表1、图5)
图4 ORF2-Huh-7互作蛋白的互作网络图Fig.4 Interaction network diagram of ORF2-Huh-7 interacting proteins
图5 GO和KEGG富集分析Fig.5 GO and KEGG enrichment analysis
通过R(4.2.1)软件筛选互作蛋白并上传STRING数据库得到23 个蛋白的相互作用网络图,发现这些蛋白之间存在复杂的互作关系(见图4),如VDAC1、ENO1、HSP90AA1、RPL7/19/24 等。
由表1可知,23个靶蛋白主要参与了生物过程(BP)有27 个、涉及的细胞组分(CC)有27 种,以及相关分子功能(MF)9个;KEGG分析得到2个途径与疾病/病毒相关。
使用R(4.2.1)版本中的ggplot2 包对GO 富集分析和KEGG 信号通路结果取前3 进行可视化,得到主要参与的BP:RNA 剪接的调控、细胞质翻译、端粒酶活性的调节;CC:胞质核糖体、空泡腔、细胞质大核糖体亚单位;MF:钙黏蛋白结合、泛素-蛋白质连接酶、蛋白质连接酶结合中的泛素;KEGG:核糖体和新型冠状病毒(见图5)。
3 讨论
探究病毒蛋白与宿主蛋白之间的相互作用,有助于揭示病毒的感染和致病机制,为提出新的抗病毒策略提供线索[7]。人HEV感染主要通过食用肉制品,HEV可在肝脏和胆汁中蓄积,也可在小肠及大肠内增殖。动物HEV 与人HEV 的分割界限越来越模糊,且猪养殖数量大、养猪业的从业人员多等因素导致猪HEV成为主要的公共卫生问题。目前研究多将猪作为HEV 的重要病毒库,且近年来HEV的关键性作用靶点也是研究热门;而且,HEV 在人群中造成规模流行需要经过进一步的遗传进化及宿主嗜性改变[8]。基于以上原因,本研究选择猪作为研究对象。
由于HEV主要以无囊膜形式传播,含有主要抗原表位的衣壳蛋白直接参与病毒对细胞的吸附和入侵[9]。近年来,为探索与病毒感染相关的宿主蛋白,针对ORF2与宿主蛋白的互作研究取得一定的进展[10]。研究发现,ORF2 可以与多种跨膜蛋白互作,参与HEV的吸附和入侵,如硫酸乙酰肝素蛋白(HSPG)[11]和脱唾液酸糖蛋白受体1/2(ASGR1/2)[12];此外,ORF2 还与一些分子伴侣相关,如与热休克蛋白90(HSP90)相互作用,参与HEV在细胞间的转运[13];ORF2过表达时,HSP72、HSP70B和HSP40等因子表达水平上调,猜测有利于HEV感染细胞抵抗凋亡[14];ORF2也可竞争性地使因子Ikβ 与Cul1 和SKP1 的结合显著减少,调节病毒的复制和增殖[15]。近期有研究发现,细胞周期调控蛋白42(CDC42)和Ras相关蛋白1b(Rap1b)直接结合ORF2,利用感染性克隆验证发现上述两种蛋白均在HEV 的早期感染阶段发挥作用[16]。综上,虽然众多与ORF2 互作的宿主蛋白已被发现,但由于缺乏高效的体外培养体系等原因,已有相关研究大多未能揭示其在HEV感染中的具体作用机制[11],且决定HEV感染的关键受体蛋白尚未被发现。因此,探索与ORF2 互作的宿主蛋白仍具有一定的科学意义,既能够发现新的参与HEV感染的宿主细胞蛋白,也有望筛选到HEV感染的关键受体。
本研究构建HEV ORF2真核表达质粒,并成功表达于HEV 易感细胞系-Huh-7 细胞中,模拟了病毒感染的细胞内环境下ORF2的表达,利用免疫共沉淀-蛋白质谱技术,初步获得与ORF2互作的37个细胞蛋白,生物信息学分析结果表明,其中23个靶蛋白存在复杂的互作网络关系;这些蛋白多参与众多细胞器的合成,参与RNA剪接的调控、细胞质翻译等生物过程,参与胞质核糖体、空泡腔等细胞器的合成,同时也在如钙黏蛋白结合、泛素-蛋白质连接酶等功能中发挥作用,并且影响核糖体合成途径、参与新型冠状病毒感染等。
Tian 等[10]和Subramani 等[11]分别利用酵母双杂交技术筛选与ORF2 互作蛋白,前者主要针对基因1 型和4 型HEV 毒株,与本研究所筛选到的靶蛋白几乎无重叠,仅有相同蛋白家族的ACTG1。而后者针对基因1 型和3 型HEV 毒株,筛选到的ORF2 互作蛋白仅有两个:PCBP1 和RPL29;RPL29 与本研究中筛选到的RPL7/19/24 属于同类蛋白。本研究筛选获得了23个靶蛋白,为ORF2互作蛋白的数据库填补了空白。其中VDAC1、ENO1和HSP90AA1等蛋白均参与病毒的感染过程[17-19],VDAC1、BAG2 和PSMB4等蛋白与癌症相关[20-22],推测可能与本试验选取的宿主细胞Huh-7是肝癌细胞相关。本研究HEV 基因型的靶向蛋白提供了依据,为后续攻克病毒至关药物靶点提供科学解释。
4 结论
本研究使HEV ORF2 的重组质粒成功表达于Huh-7细胞中,经免疫共沉淀分析、银染和蛋白质谱分析获得37 个靶蛋白,生物信息学分析其涉及的细胞成分、通路途径和疾病与病毒的关系,为后续深入研究其他HEV基因型以及动物与宿主间的细胞蛋白与ORF2 的互作及其在HEV感染中的分子机制及兽用药物靶点提供了一定参考。