猪PPARγΔ5 组织表达及生物信息分析

宋苏堤，魏 芳，李帅兵，符 璐，卢建雄，张国华

（ 西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730124 ）

转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）对细胞分化和脂质代谢起到重要调控作用。与其他核激素受体转录因子相同，PPARγ具有C-端配体结合域（LBD），与配体结合后被激活，结合到特定的DNA 序列过氧化物酶体增殖物反应元件（PPREs）反式激活靶基因转录。研究表明，PPARγ调控包括脂肪形成、脂肪储存、脂肪因子分泌和胰岛素敏感性在内的多个生物学过程，是调控脂肪细胞分化的核心调控因子[1]，具有调节脂肪合成、糖脂代谢和细胞增殖分化等生物学功能[2]。

选择性剪接（AS）是真核生物基因转录后调控的重要机制，可对基因表达谱进行重新编程，增加转录组和蛋白质组的多样性。研究发现，PPARγ外显子5跳跃是一种自然发生的选择性剪接事件[3]。PPARγ基因外显子6含有丝氨酸/精氨酸富集剪接因子1（SRSF1）的结合位点[4]，SRSF1与PPARγ外显子6结合有助于其前体mRNA跳过外显子5发生选择性剪接并产生亚型PPARγΔ5[3]。在人类皮下和内脏脂肪组织、脂肪细胞等均检出PPARγΔ5表达，参与脂肪细胞分化及生脂调控[5]。猪脂肪组织高水平表达PPARγ3，是脂肪细胞分化的主要调控因子，其编码基因与人PPARγ 基因均由7 个外显子组成，具有很高的同源性。但猪机体组织是否也存在PPARγ 前体mRNA 外显子5 跳跃的选择性剪接及其可能的作用机制尚不清楚。本研究在检测分析猪组织器官PPARγΔ5 表达的基础上，利用生物信息学方法比较分析猪PPARγΔ5及PPARγ蛋白生物信息特征，为深入了解猪脂肪形成的调控机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

选取健康的180 d“杜×大×长”三元杂交猪6头，体重为（88.71±2.53） kg，由兰州瑞源农业科技有限公司提供。禁食12 h，屠宰，立即采集心脏、肝脏、皮下脂肪组织和背最长肌，磷酸缓冲液（PBS）冲洗后放入液氮中冻存。

1.2 RNA提取及cDNA合成

TRIzol 法分别提取猪各组织总RNA。以提取的总RNA为模板，按照反转录试剂盒合成cDNA，-20 ℃保存。

1.3 引物设计与合成

以猪PPARγ mRNA序列（NM_214379.1）为模板，分别在PPARγ 基因外显子4 和5 的序列内设计PPARγ PCR 扩增引物，在外显子3 内和外显子4 与6 的连接处序列设计PPARγΔ5 引物。PPARγΔ5 实时荧光PCR 扩增引物序列为F：5'-GG-GATAAAGCCTCGGGGTTC-3'；R：5'-ACAAAGGGCGT-TATGAGACAT-3'；产物长度212 bp。PPARγ 引物为F：5'-TTATTGACCCAGAAAGCG-3'；R：5'-AGGATTTCATACCGCAGG-3'；产物长度88 bp。β-actin（DQ845171.1）为内参基因，引物序列为F：5'-AGG-CCAACCGTGAGAAGATG-3'；R：5'-CATGACAATGCCAGTGGTGC-3'；产物长度122 bp。引物由湖南艾科瑞生物工程有限公司合成。

1.4 实时荧光PCR扩增

使用实时荧光定量PCR试剂盒进行PCR扩增，操作按生产商使用说明书进行。以β-actin为内参基因，用2-△△Ct法计算PPARγ和PPARγΔ5相对表达量。

1.5 生物信息学分析

利用NCBI 的BLAST 功能，比对猪PPARγ3 mRNA（NM_214379.1）和PPARγ 基因序列，获得外显子5跳跃的PPARγΔ5 mRNA序列，在线程序分析PPARγ蛋白序列。

使用在线预测软件ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析PPARγ 和PPARγΔ5 蛋白理化性质；使用ProtScale（https: //web.expasy.org/protscale/）分析蛋白亲疏水性；使用SOPMA（https: //npsa-prabi.ibcp.fr/）进行二级结构预测；使用SWISS-MODEL（https: //swissmodel.expasy.org/）进行三级结构预测；使用TMHMM（http: //www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）分析跨膜结构域；使用SignalP-5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测信号肽；使用PSORT Ⅱ Prediction （https: // psort.hgc.jp/form2.html）分析亚细胞定位；使用NetPhos（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析磷酸化位点。

1.6 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 19.0 软件进行单因素方差分析，Duncan's 法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 PPARγ 和PPARγΔ5在猪不同组织中的表达、相关性分析（见图1、图2）

图1 PPARγ和PPARγΔ5在猪不同组织中的表达Fig.1 Expression of PPARγ and PPARγΔ5 in different tissues of pigs

图2 PPARγ和PPARγΔ5在猪不同组织中表达的相关性分析Fig.2 Correlation analysis of PPARγ and PPARγΔ5 expression in different tissues of pigs

由图1、图2可知，在猪心脏、肝脏、皮下脂肪组织和背最长肌中均检测到PPARγΔ5 和PPARγmRNA 表达，表达水平依次为皮下脂肪组织、背最长肌、肝脏和心脏，PPARγΔ5 和PPARγmRNA 表达水平差异极显著（P＜0.01）。各组织PPARγΔ5mRNA 表达均极显著低于PPARγ（P＜0.01），且二者显著正相关（P＜0.05）。

2.2 PPARγ 和PPARγΔ5蛋白理化性质及氨基酸组成（见图3、表1）

表1 PPARγ和PPARγΔ5蛋白的氨基酸组成Tab.1 Amino acid composition of PPARγ and PPARγΔ5 proteins

图3 PPARγ和PPARγΔ5蛋白亲疏水性分析Fig.3 Hydrophilic analysis of PPARγ and PPARγΔ5 proteins

采用ProtParam 在线软件预测表明，PPARγ 和PPARγΔ5 蛋白分子量分别为57 512.10、23 929.09 u，分子式分别为C2575H4046N670O766S27、C1054H1610N282O322S17，脂肪族氨基酸指数分别为88.04、66.38，理论等电点（PI）分别为5.60、5.68，均属酸性蛋白；不稳定系数分别为49.18、54.26，表明理化性质均不稳定，理论半衰期均为30 h。PPARγ带负电荷与正电荷氨基酸残基（Asp与Arg）总数分别为71和58，PPARγΔ5 带负电荷与正电荷氨基酸残基（Glu 与Lys）总数分别为29和22。

由图3 可知，PPARγ 蛋白的肽链大部分位于亲水区域，为亲水蛋白。其中，第416位异亮氨酸残基的疏水性最强，分值为3.65；第128 位谷氨酸残基亲水性最强，分值为-2.76。PPARγΔ5 蛋白的肽链大部分位于亲水区域，为亲水蛋白。其中，第137位谷氨酸残基的疏水性最强，分值为1.47；第127位谷氨酸残基的亲水性最强，分值为-2.72。

由表1 可知，PPARγ 和PPARγΔ5 蛋白均含20 种氨基酸。PPARγ 由504 个氨基酸组成，其中亮氨酸占比为10.5%；赖氨酸占比为7.7%；组氨酸、半胱氨酸及色氨酸占比分别为2.8%、2.0%和0.2%。PPARγΔ5由210个氨基酸组成，其中丝氨酸占比为9.5%；天冬氨酸占比为8.6%；谷氨酰胺和色氨酸占比分别为2.9%和0.5%。

2.3 PPARγ 和PPARγΔ5蛋白的二级和三级结构预测（见表2、图4、图5）

表2 PPARγ和PPARγΔ5蛋白的二级结构占比Tab.2 Secondary structure proportion of PPARγ and PPARγδ5 proteins 单位：%

图4 PPARγ和PPARγΔ5蛋白二级结构预测Fig.4 Secondary structure prediction of PPARγ and PPARγΔ5 proteins

图5 PPARγ和PPARγΔ5蛋白三级结构建模Fig.5 Tertiary structure modeling of PPARγ and PPARγΔ5 proteins

由表2可知，PPARγ、PPARγΔ5蛋白二级结构中α-螺旋、无规则卷曲、β-转角和延伸链分别占50.00%、31.75%、6.35%、11.90%和21.43%、49.05%、7.62%、21.90%。

由图5可知，PPARγ蛋白三级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主，PPARγΔ5 蛋白三级结构以无规则卷曲和延伸链为主，与二级结构预测结果相符。

2.4 PPARγ 和PPARγΔ5 蛋白跨膜螺旋结构和信号肽预测（见图6、图7）

图6 PPARγ和PPARγΔ5蛋白跨膜螺旋结构预测Fig.6 Prediction of transmembrane helical structure of PPARγ and PPARγΔ5 proteins

图7 PPARγ和PPARγΔ5蛋白信号肽预测Fig.7 PPARγ and PPARγΔ5 protein signal peptide prediction

由图6、图7 可知，猪PPARγ 和PPARγΔ5 两种蛋白均无跨膜螺旋结构、无信号肽，属于非分泌蛋白。

2.5 PPARγ 和PPARγΔ5 蛋白亚细胞定位和磷酸化位点（见图8、图9）

图8 PPARγ和PPARγΔ5蛋白亚细胞定位Fig.8 Subcellular localization of PPARγ and PPARγΔ5 proteins

图9 PPARγ和PPARγΔ5蛋白磷酸化位点Fig.9 Phosphorylation sites of PPARγ and PPARγΔ5 proteins

由图8可知，PPARγ蛋白约56.6%定位于细胞质；细胞核约占21.8%；过氧化物酶体约占8.7%；内质网、质膜和线粒体均约占4.3%。PPARγΔ5 约82.7%定位于细胞核；细胞质约占8.7%；线粒体和过氧化物酶体均约占4.3%。

由图9可知，PPARγ蛋白氨基酸序列中共有48个潜在的磷酸化位点，其中包括27个Ser磷酸化位点、13个Thr磷酸化位点、8 个Tyr 磷酸化位点。PPARγΔ5 蛋白氨基酸序列中共有25个潜在的磷酸化位点，其中包括13个Ser磷酸化位点、8个Thr磷酸化位点、4个Tyr磷酸化位点。

2.6 PPARγ和PPARγΔ5结构域预测（见图10～图13）

图10 PPARγ蛋白结构域Fig.10 PPARγ protein domain

PPARγ 具有由锌指结构（ZnF-C4）构成的DNA 结合域（DBD）、可变的N 端调控域、柔性铰链和C 端配体结合域（LBD）。

由图10、图11 可知，猪PPARγ 外显子5 由200 个核苷酸组成，编码PPARγ 蛋白质第206～272 位氨基酸，第236～503位氨基酸构成其LBD。

由图12、图13 可知，PPARγ 外显子5 跳跃产生的PPARγΔ5由于编码框移位，终止密码子提前，虽然具有完整的N端调控域和DBD结构域，但缺失了LBD结构。

图12 PPARγΔ5蛋白缺失LBD氨基酸序列Fig.12 PPARγΔ5 protein lacks the LBD amino acid sequence

图13 PPARγΔ5蛋白结构域Fig.13 PPARyΔ5 protein domain

3 讨论

PPARγ是配体激活的核激素受体转录因子，调节脂肪细胞分化、脂肪生成和胰岛素敏感性等多个生物学过程。PPARγ 是脂肪细胞分化的主要调控子，尚无在PPARγ 缺失时其他因子可促进该细胞进程的相关研究[6]。SRSF1与PPARγ外显子6结合有助于其前体mRNA跳过外显子5发生选择性剪接，是因为PPARγ外显子6中有SRSF1的结合位点[4]。有研究发现，人类脂肪组织及脂肪细胞均表达PPARγ Δ 5，并在脂肪形成的调控中起到重要作用[4]。PPARγ3 是猪脂肪细胞分化的主要调控因子，其mRNA 与人PPARγ序列均由7个外显子序列组成，同源性较高。然而，猪PPARγ 前体mRNA 是否也通过选择性剪接产生PPARγΔ5 的研究尚未见报道。本试验对猪4 个组织器官进行检测，结果表明，猪心脏、肝脏、皮下脂肪组织和背最长肌均表达PPARγΔ5，其组织表达变化与PPARγ一致，即在皮下脂肪组织表达水平最高，其次为背最长肌和肝脏，心脏表达水平最低，且表达水平在同一组织都显著低于PPARγ。此外，PPARγΔ5 和PPARγ 的表达显著正相关。上述结果均提示PPARγΔ5可能在猪脂肪细胞分化及脂肪形成中起到重要作用。

对蛋白质结构域的分析表明，与PPARγ 相同，PPARγΔ5 蛋白也具有DBD 结构域和N 端调控域，可与启动子上的PPREs 序列结合调控靶基因转录[7]。研究表明，经天然配体脂肪酸衍生物或合成配体如罗格列酮激活后，PPARγ与其分子伴侣维甲酸X受体α（RXRα）形成异二聚体，通过激活靶基因表达[8]，调控各种细胞过程，包括细胞成脂分化[9]。尽管PPARγΔ5 由于选择性剪接产生的外显子5 跳跃致使蛋白质编码框移位，终止密码子提前，导致PPARγΔ5 缺失LBD 结构，丧失了配体结合功能[3]，但可通过竞争RXRα对野生型PPARγ活性产生显性负性作用，从而调控脂肪细胞的分化[5]。因此，PPARγΔ5可能在猪脂肪细胞分化调控及其他生物学过程中发挥作用。

转录因子的反式激活活性调控包括蛋白质表达水平、配体结合及转录辅因子互作等多种方式。蛋白质翻译后修饰可改变蛋白质构象、蛋白质互作及受体和配体间的亲和力，从而调节下游基因的转录[10]。对磷酸化位点的信息分析表明，PPARγ 和PPARγΔ5 具有丰富的磷酸化位点。蛋白质磷酸化是调节PPARγ 活性的主要途径之一[11]。在不同的刺激下，PPARγ 可以在不同的位点磷酸化，从而产生多样的生物学效应[12]。细胞周期素依赖性蛋白激酶（CDK）和丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）主要在Ser273[12-13]和Ser112 位点[14-15]磷酸化PPARγ。CDK5 介导的Ser273磷酸化降低PPARγ转录活性及脂肪形成，而CDK9/CDK7介导的Ser112 磷酸化可增强PPARγ 活性，促进细胞成脂分化[14-16]。CDK5 对PPARγ 的磷酸化可能有助于其与辅激活子过氧化物酶体增殖物激活受体-γ 辅激活因子1（PGC-1）和转录中介因子2（TIF2）的解离，促进与辅抑制子（SMRT）和核受体辅阻遏子（NCoR）相互作用[13]。NCoR可通过稳定CDK5 调节Ser273 位点的PPARγ 磷酸化[17]。当LBD 没有与配体结合时，PPARγ/RXRα 与一些辅抑制因子如NCoR 结合；而当配体结合到LBD 时，PPARγ 构象改变，辅抑制因子被一些辅激活因子如cAMP反应元件结合蛋白（CREBP）、PGC-1 等取代[18]。PPARγ 与配体的结合及对辅因子的招募改变时，其反式激活活性和生物学功能将相应改变。PPARγΔ5 与PPARγ 相似，具有多个潜在的磷酸化位点，但由于其缺失LBD 结构域，可能对磷酸化修饰过程产生影响，从而导致生物学功能的改变。

PPARγΔ5 蛋白质的理化性质与PPARγ 类似，其肽链大部分位于亲水区域，二级结构中主要为α-螺旋和无规则卷曲，β-转角较少，容易形成球状蛋白，符合亲水性蛋白的特征。无规则卷曲通常也是蛋白质分子行使功能和构象变化的重要区域。对跨膜螺旋结构及亚细胞定位分析表明，两种蛋白均无跨膜螺旋结构及信号肽结构，为非分泌蛋白，且主要定位于细胞核和细胞质，推测PPARγΔ5可能与PPARγ一样作为核转录因子发挥作用。此外，蛋白结构的稳定性在很大程度上取决于分子内部的疏水作用，猪PPARγ 和PPARγΔ5 蛋白不稳定指数均大于40，说明两个蛋白的结构稳定性较差，在细胞内发挥作用后可快速降解。

4 结论

PPARγΔ5 是PPARγ 的选择性剪接亚型，猪皮下脂肪组织、背最长肌、肝脏和心脏均表达PPARγΔ5，且表达水平与PPARγ 正相关。对PPARγΔ5 和PPARγ 蛋白生物信息比较分析表明，PPARγΔ5为亲水性非分泌蛋白，稳定性差，含有丰富的磷酸化位点，具有核转录因子的特征，可能通过竞争性的结合RXRα 抑制PPARγ 反式激活活性。PPARγΔ5 缺失LBD 结构域，其活性不依赖PPARγ 配体，可能具有与PPARγ不同的生物学功能，但尚需试验验证。