苓桂术甘汤对慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜及ADAM17/EGFR通路影响研究

张 玲,曾微微,羊章凯,麦联任

(海南省中医院,海南 海口 570000)

慢性萎缩性胃炎为临床中常见的消化系统疾病,以腹部不适、食欲不振为主要临床特点,如不及时干预,可能进展为癌前病变,甚至进展为胃癌。目前,临床中对于慢性萎缩性胃炎的治疗药物有限,同时表现出有效率低、疗程长、患者依从性差等特点[1-2],所以对于慢性萎缩性胃炎治疗药物的研发仍是当前的工作重点。去整合素金属蛋白酶17(ADAM17)/表皮生长因子受体(EGFR)通路是近年来研究发现的与慢性萎缩性胃炎的发生及进展密切相关的重要信号通路,林海燕等[3]研究发现抑制EGFR的过度表达可修复慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜病理损伤;Chen等[4]研究证实调节ADAM17/EGFR通路能够显著抑制胃黏膜炎症损伤,增强胃黏膜组织细胞防御能力,进而修复胃黏膜,抑制慢性萎缩性胃炎大鼠疾病进展。苓桂术甘汤为经典祛湿剂,其在消化系统疾病特别是胃病治疗中显示出较好疗效[5]。本研究基于ADAM17/EGFR通路探讨了苓桂术甘汤对慢性萎缩性胃炎大鼠的作用,旨在为该药的作用提供新的理论依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠63只,6周龄,体重200～220 g,购自海南药物研究所有限责任公司,实验动物生产许可证号:SCXK(琼)2020-0007,饲养于实验动物房,温度20～25 ℃,相对湿度40%～70%,昼夜交替12 h。实验动物的使用经伦理委员会审批通过(K20220420108)。

1.2药品及试剂 苓桂术甘汤由药材饮片茯苓(批号:190811)12 g、桂枝(批号:191012)9 g、白术(批号:190527)9 g、炙甘草(批号:190326)6 g组成,饮片由北京同仁堂药业有限公司生产,将饮片置于1 000 mL蒸馏水中浸泡4 h,煎煮2 h,过滤,收集滤液,将药材残渣置于1000mL蒸馏水中再次煎煮30 min,过滤并收集滤液,合并2次滤液,蒸发浓缩制成生药含量为0.72 g/mL的药液;维酶素,四川大冢制药有限公司,批号:210702;1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(MNNG,货号:HY-128612)购自美国MedChemExpress公司;二喹啉甲酸(BCA,货号:PC0020)、磷酸盐缓冲液(PBS,货号P1020)、化学发光液(货号:PE0010)、组织裂解液(货号:R0010)、酚酞指示剂(货号:G2860)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测试剂盒(货号:SEKR-0009)、C反应蛋白(CRP)检测试剂盒(货号:SEKR-0017)、白细胞介素-1β(IL-1β)检测试剂盒(货号:SEKR-0002)、白细胞介素-10(IL-10)检测试剂盒(货号:SEKR-0006)、胃蛋白酶活性测定试剂盒(货号:BC2320)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒(货号:BC1195)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体(货号:SE134)购自北京索莱宝生物科技有限公司;氢氧化钠(NaOH,货号:1310-73-2)购自西格玛奥德里奇贸易有限公司;胃泌素(GAS)检测试剂盒(货号:FY-A014832)购自上海富雨生物科技有限公司;胃动素(MTL)检测试剂盒(货号E-EL-R0639c)购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;一氧化氮(NO)测定试剂盒(货号:E1030-8)购自北京普利莱基因技术有限公司;P选择素(SELP)测定试剂盒(货号:ER0124)购自武汉菲恩生物科技有限公司;白细胞内皮细胞黏附分子-1(LECAM-1)测定试剂盒(货号:E07431r)购自武汉华美生物工程有限公司;内皮素-1(ET-1)测定试剂盒(货号:ARB12078)购自北京百奥莱博科技有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(货号:S0101)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(货号:S0131)、HE染色试剂盒(货号:C0105)购自碧云天生物科技有限公司;RNA提取试剂盒(货号:WLA088)、反转录试剂盒(货号:WLA101)、2×PCR Master Mix With Indicator(货号:WLA071)购自沈阳万类生物科技有限公司;表皮生长因子(EGF,货号:ab184265)、EGFR(货号:ab52894)、ADAM17(货号:ab39162)、GAPDH(货号:ab181602)兔抗体购自艾博抗(上海)贸易有限公司;PCR引物设计与合成由赛默飞世尔科技有限公司完成。

1.3仪器与设备 Gel Doc EZ凝胶成像仪(美国BIO-RAD公司);DMi8荧光倒置显微镜(德国Leica公司);NX-1R高速冷冻离心机(鼎昊源生物科技有限公司);CLARIOstar PLUS酶标仪(德国BMG LABTECH公司)。

1.4实验方法 随机取10只大鼠作为正常对照组,其余大鼠参照文献[6]方法制备慢性萎缩性胃炎模型,即大鼠自由饮用100 μg/mL的MNNG溶液,同时饱食1 d、禁食1 d交替喂养,共持续56 d,随机取3只大鼠进行胃组织病理学检查,以胃黏膜及腺体萎缩视为造模成功。将造模成功的大鼠采用随机数字表法分为萎缩性胃炎组,维酶素组及苓桂术甘汤低、中、高剂量组,每组10只。苓桂术甘汤低、中、高剂量组参考文献[7]给药剂量分别给予1.8 g/kg、3.6 g/kg、7.2 g/kg的苓桂术甘汤灌胃,维酶素组参考文献[8]给药剂量给予0.2 g/kg维酶素灌胃,萎缩性胃炎组及正常对照组给予生理盐水灌胃,均1次/d,连续30 d。

1.5检测指标及方法

1.5.1体重 分别于造模完成后及末次灌胃结束12 h后测量各组大鼠体重。

1.5.2血清GAS、MTL、TNF-α、CRP、IL-1β、IL-10水平 大鼠禁食12 h,腹腔注射戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉大鼠后,取仰卧位,沿腹部正中切开,腹主动脉取血,4 ℃静置30 min,4 ℃下3 500 r/min离心15 min,取上清,使用试剂盒测定各指标水平。

1.5.3胃液酸度及胃蛋白酶活性 取血后,结扎幽门并向胃内注射2 mL蒸馏水,15 min后分离全胃并收集胃液,取一部分胃液,以酚酞为指示剂,使用NaOH滴定分析胃液总酸度;另一部分胃液以8 000 r/min室温离心10 min,取上清液,使用试剂盒测定胃蛋白酶活性。

1.5.4胃黏膜组织中NO、SELP、LECAM-1、ET-1、SOD、MDA、GSH-Px含量 取大鼠胃黏膜组织,研磨匀浆,4 ℃下8 000 r/min离心10 min,取上清液,使用试剂盒测定各指标含量。

1.5.5胃黏膜组织病理学形态 取大鼠胃黏膜组织,置于10%中性福尔马林溶液中浸泡24 h,使用石蜡包埋后制成5 μm切片,常规HE染色后置于光学显微镜下观察拍照。

1.5.6胃黏膜组织中EGF、EGFR、ADAM17 mRNA表达情况 取大鼠胃黏膜组织,提取分离总RNA,反转录为cDNA,PCR试剂盒测定EGF、EGFR及ADAM17 mRNA表达量。反应体系:正反向引物各2 μL,模板DNA 2 μL,2×PCR Master Mix With Indicator 25 μL,使用蒸馏水补充至50 μL。反应程序:94 ℃起始变性3 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72℃延伸1min,进行30个循环,72℃最终延伸10 min。结果以GAPDH为内参,采用2-ΔΔCT法计算相对表达量。EGF、EGFR、ADAM17、GAPDH引物序列见表1。

表1 EGF、EGFR、ADAM17、GAPDH引物序列

1.5.7胃黏膜组织中EGF、EGFR、ADAM17蛋白表达情况 取大鼠胃黏膜组织,使用组织裂解液在匀浆器中研磨匀浆后,4 ℃下8 000 r/min离心10 min,取上清,使用BCA试剂盒测定蛋白总浓度并取相当于50 μg蛋白的上清液,上样、电泳分离,电转移至聚偏氟乙烯膜,使用体积分数为5%的脱脂奶粉作为封闭液,室温封闭1 h,PBS清洗3次,分别加入EGF、EGFR、ADAM17、GAPDH兔抗体(1∶500稀释),4 ℃条件下孵育过夜,PBS再次清洗3次,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(1∶2 000稀释),室温孵育2 h,PBS清洗3次后,置于凝胶分析仪,滴加化学发光液,显影拍照,使用Image 1.12.0软件,以GAPDH为内参,计算各蛋白相对表达量。

1.6统计学方法 所有数据使用SPSS 26.0软件进行数据处理分析,计量资料均呈正态分布,多组间比较采有单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠体重比较 造模完成后,各造模组大鼠体重均明显低于正常对照组(P均<0.05),各造模组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。灌胃结束后,萎缩性胃炎组大鼠体重明显低于正常对照组(P<0.05);苓桂术甘汤各组及维酶素组大鼠体重均明显高于萎缩性胃炎组(P均<0.05);苓桂术甘汤各组随着苓桂术甘汤剂量的增加,大鼠体重逐渐增加,组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 正常对照组和慢性萎缩性胃炎各组大鼠体重比较

2.2各组大鼠血清GAS、MTL、TNF-α、CRP、IL-1β、IL-10水平比较 与正常对照组比较,萎缩性胃炎组大鼠血清GAS、IL-10水平均明显降低(P均<0.05),血清MTL、TNF-α、CRP、IL-1β水平均明显升高(P均<0.05);与萎缩性胃炎组比较,苓桂术甘汤各组及维酶素组大鼠血清GAS、IL-10水平均明显升高(P均<0.05),血清MTL、TNF-α、CRP、IL-1β水平均明显降低(P均<0.05);苓桂术甘汤各组随着苓桂术甘汤剂量的增加,血清GAS、IL-10水平均逐渐升高,血清MTL、TNF-α、CRP、IL-1β水平均逐渐降低,组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表3。

表3 正常对照组和慢性萎缩性胃炎各组大鼠血清GAS、MTL、TNF-α、CRP、IL-1β及IL-10水平比较

2.3各组大鼠胃液酸度及胃蛋白酶活性比较 萎缩性胃炎组大鼠胃液酸度及胃蛋白酶活性均明显低于正常对照组(P均<0.05);苓桂术甘汤各组及维酶素组大鼠胃液酸度及胃蛋白酶活性均明显高于萎缩性胃炎组(P均<0.05);苓桂术甘汤各组随着苓桂术甘汤剂量的增加,大鼠胃液酸度及胃蛋白酶活性均逐渐升高,组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表4。

表4 正常对照组和慢性萎缩性胃炎各组大鼠胃液酸度及胃蛋白酶活性比较

2.4各组大鼠胃黏膜组织中NO、SELP、LECAM-1、ET-1、SOD、MDA、GSH-Px含量比较 与正常对照组比较,萎缩性胃炎组大鼠胃黏膜组织中SOD及GSH-Px含量均明显降低(P均<0.05),NO、SELP、LECAM-1、ET-1、MDA含量均明显升高(P均<0.05);与萎缩性胃炎组比较,苓桂术甘汤各组及维酶素组大鼠胃黏膜组织中SOD及GSH-Px含量均明显升高(P均<0.05),NO、SELP、LECAM-1、ET-1、MDA含量均明显降低(P均<0.05);苓桂术甘汤各组随着苓桂术甘汤剂量的增加,胃黏膜组织中SOD及GSH-Px含量均逐渐升高,NO、SELP、LECAM-1、ET-1、MDA含量均逐渐降低,组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表5。

表5 正常对照组和慢性萎缩性胃炎各组大鼠胃黏膜组织NO、SELP、LECAM-1、ET-1、SOD、MDA、GSH-Px含量比较

2.5各组大鼠胃黏膜组织病理形态 正常对照组大鼠胃黏膜组织无明显病理学改变;萎缩性胃炎组大鼠胃黏膜组织萎缩性改变,炎症细胞浸润,胃黏膜细胞脱落,腺体萎缩;与萎缩性胃炎组比较,苓桂术甘汤各组及维酶素组大鼠胃黏膜组织病理学明显改善。见图1。

图1 正常对照组和慢性萎缩性胃炎各组大鼠胃黏膜组织病理学形态(HE,×200)

2.6各组大鼠胃黏膜组织中EGF、EGFR、ADAM17 mRNA相对表达量比较 萎缩性胃炎组大鼠胃黏膜组织中EGF、EGFR、ADAM17 mRNA相对表达量均明显高于正常对照组(P均<0.05);苓桂术甘汤各组及维酶素组大鼠胃黏膜组织中EGF、EGFR、ADAM17 mRNA相对表达量均明显低于萎缩性胃炎组(P均<0.05);苓桂术甘汤各组随着苓桂术甘汤剂量的增加,胃黏膜组织中EGF、EGFR、ADAM17 mRNA相对表达量均逐渐降低,组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表6。

表6 正常对照组和慢性萎缩性胃炎各组大鼠胃黏膜组织中EGF、EGFR、ADAM17 mRNA相对表达量比较

2.7各组大鼠胃黏膜组织中EGF、EGFR、ADAM17蛋白表达情况比较 萎缩性胃炎组大鼠胃黏膜组织中EGF、EGFR、ADAM17蛋白相对表达量均明显高于正常对照组(P均<0.05);苓桂术甘汤各组及维酶素组大鼠胃黏膜组织中EGF、EGFR、ADAM17 蛋白相对表达量均明显低于萎缩性胃炎组(P均<0.05);苓桂术甘汤各组随着苓桂术甘汤剂量的增加,胃黏膜组织中EGF、EGFR、ADAM17 蛋白相对表达量均逐渐降低,组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图2。

图2 正常对照组和慢性萎缩性胃炎各组大鼠胃黏膜组织中EGF、EGFR、ADAM17蛋白表达情况

3 讨 论

慢性萎缩性胃炎的发生与幽门螺杆菌感染、饮酒等不良生活习惯、遗传因素、自身免疫系统紊乱等多种因素有关[9]。目前,临床中对于慢性萎缩性胃炎的治疗主要以抑制胃酸、改善胃动力、保护胃黏膜为主,但有些患者病情仍然会进展[10],因此中西医结合治疗萎缩性胃炎成为研究热点。

中医理论认为,慢性萎缩性胃炎是由于脾胃虚弱,阳气虚衰,运化失司,痰湿内生而致胃络瘀阻。因此,慢性萎缩性胃炎的治疗以益气健脾、清热化湿为主。苓桂术甘汤具有温阳健脾、利水消肿之功效,方中茯苓健脾利湿、温阳化饮,桂枝通阳化气、平冲降逆,白术燥湿利水、健脾益气,甘草调和诸药。赵松峰[11]研究表明,苓桂术甘汤联合西药治疗较单独使用西药治疗能够显著减轻脾胃病患者胃脘疼痛、泛酸等症状;李杰等[12]研究发现,苓桂术甘汤能够改善慢性心力衰竭胃动力下降患者胃肠道症状及胃排空时间,恢复胃肠道功能;林博等[13]研究证实,苓桂术甘汤能够显著改善功能型消化不良患者血流动力学状态,调节胃蛋白酶活性。由此可见,苓桂术甘汤在胃肠道系统疾病的治疗中具有较大潜力,但其是否可用于慢性萎缩性胃炎的治疗及机制尚不明确,所以本实验进行相关探讨。

血清GAS、MTL水平与慢性萎缩性胃炎的发生及进展有关。杨国红等[14]研究证实GAS、MTL水平是慢性萎缩性胃炎不同中医证候转化的客观物质基础及重要参考指标。朱萱萱等[15]实验研究表明脾气虚证大鼠血清GAS水平降低,血清MTL水平升高,二者可一定程度反映胃黏膜功能受损情况。炎症反应水平与慢性萎缩性胃炎患者胃黏膜病变程度正相关,成映霞等[16]研究报道,慢性萎缩性胃炎大鼠胃组织中TNF-α、IL-1β含量显著升高,抑制炎症因异常分泌可保护胃黏膜。黄铭涵等[17]报道,慢性萎缩性胃炎大鼠血清IL-10水平降低,上调其表达可减轻胃黏膜损伤。胃液酸度与慢性萎缩性胃炎相关性癌前病变的发生密切相关,提高胃液酸度能够抑制胃癌前病变[18];胃蛋白酶活性是反映胃黏膜完整性及腺体功能的常用指标,该酶活性降低提示胃黏膜及腺体功能下降[19]。本实验结果表明,与正常对照组比较,萎缩性胃炎组大鼠血清GAS及IL-10水平、胃液酸度及胃蛋白酶活性均明显降低;血清MTL、TNF-α、CRP、IL-1β水平均明显升高,胃黏膜组织出现明显病理改变;与萎缩性胃炎组比较,苓桂术甘汤各组大鼠血清GAS及IL-10水平、胃液酸度及胃蛋白酶活性均明显升高,血清MTL、TNF-α、CRP、IL-1β水平均明显降低,胃黏膜病理改变明显改善,且苓桂术甘汤各组随着苓桂术甘汤剂量的增加,各项指标变化更明显。提示苓桂术甘汤能够呈剂量依赖性减轻慢性萎缩性胃炎大鼠炎症反应,修复胃黏膜,促进胃黏膜腺体功能的恢复。

目前研究证实,慢性萎缩性胃炎的发生发展与氧化应激损伤、炎症反应密切相关。李宁宁等[20]研究报道,慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜组织中SOD、GSH-Px活性较正常大鼠显著降低,MDA活性较正常大鼠明显升高,证实慢性萎缩性胃炎大鼠存在氧化应激损伤。魏盛等[21]研究证实,NO会影响慢性萎缩性胃炎大鼠胃内pH与胃黏液量,进而影响胃黏膜病理进展。白敏等[22]研究证实慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜组织诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达上调,内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达下调, 下游因子NO、SELP、LECAM-1、ET-1分泌增加。李万瑀等[23]研究表明,ET-1水平升高与慢性萎缩性胃炎患者免疫功能紊乱及胃黏膜损伤密切相关。本实验结果显示,苓桂术甘汤能够显著降低大鼠胃黏膜组织中NO、SELP、LECAM-1、ET-1、MDA含量,升高SOD及GSH-Px含量,提示苓桂术甘汤可抑制慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜炎症和氧化应激损伤。

近年来关于慢性萎缩性胃炎发生发展的相应机制研究发现,胃黏膜组织中EGF、EGFR表达上调与慢性萎缩性胃炎的发生及胃黏膜细胞的过度增殖密切相关,抑制胃黏膜中EGF、EGFR表达能促进胃黏膜修复[24-25]。白雪峰等[26]研究证实,慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜组织中ADAM17、EGFR蛋白水平明显升高,下调ADAM17、EGFR表达能够修复胃黏膜,促进胃黏膜功能恢复,抑制病情进展。本实验结果显示,萎缩性胃炎组大鼠胃黏膜组织中EGF、EGFR、ADAM17 mRNA及蛋白表达量均较正常对照组明显升高,苓桂术甘汤各组大鼠胃黏膜组织中EGF、EGFR、ADAM17 mRNA及蛋白表达量均明显降低,提示苓桂术甘汤能够通过调控EGF、EGFR、ADAM17的表达而修复慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜组织病变。

综上所述,苓桂术甘汤能够抑制慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜组织炎症损伤,调节胃液酸度及胃蛋白酶活性,促进胃黏膜组织病理学改变及功能的恢复,其机制可能与调节ADAM17/EGFR通路有关。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。