蜕皮甾酮对皮肤光老化和黑色素生成的影响

龙剑文,张 晨,李杨玺宇

(1. 湖北中医药大学第一临床学院,湖北 武汉 430061;2. 湖北中医药大学中医临床学院,湖北 武汉 430061)

紫外线通过产生活性氧引起皮肤光老化,导致皮肤起皱和下垂[1],且能刺激皮肤黑色素细胞产生色沉,因此,防治皮肤光老化和减少皮肤色沉是皮肤科重要研究方向。蜕皮甾酮是中药牛膝中甾酮类的主要成分[2],其具有良好的清除自由基和抗氧化活性[3],可抑制紫外线诱导的人晶状体上皮细胞凋亡和白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的关节软骨细胞退变[4-5]。牛膝具有显著的抗衰老、养生与美容作用[6],蜕皮甾酮作为中药牛膝的主要成分之一,是否具有抗光老化和抗黑色素生成作用尚不清楚。本研究以角质形成细胞(HaCaT细胞)、黑素细胞(B16F10细胞)和人真皮成纤维细胞(HDF细胞)为研究对象,观察了蜕皮甾酮抗光老化和抗黑色素生成的作用,现将结果报道如下。

1 实验材料与方法

1.1材料 蜕皮甾酮(纯度≥95%),中国药品生物制品检定所生产,批号:111638-202102。 HaCaT细胞株、B16F10细胞株和HDF细胞株均购于武汉大学中国典型培养物保藏中心。

1.2试剂和仪器 0.25%胰酶、DMEM培养基、胎牛血清购于美国Gibco公司。MTT试剂盒购于Abcam公司。Hoechst 33258为美国Sigma公司产品。Annexin V/PI凋亡检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。基质金属蛋白酶-1(MMP-1)抗体(GTX636661,1∶3 000)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)抗体(GTX100458,1∶2 000)、环氧化酶-2(COX-2)抗体(GTX100656,1∶2 000)、Ⅰ型胶原蛋白Iα1肽链(COL1A1)抗体(GTX112731,1∶1 000)、透明质酸合成酶2(HAS-2)抗体(GTX01068,1∶1 000)、沉默调节蛋白1(Sirt-1)抗体(GTX00951,1∶1 000)、转谷氨酰胺酶1(TGM1)抗体(GTX32921,1∶1 000)、GAPDH( GTX100118,1∶3 000) 均购于美国GeneTex公司;蘑菇酪氨酸酶购于美国 Sigma-Aldrich公司;左旋多巴、熊果苷购于麦克林公司;人α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)购于美国Sigma-Aldrich公司。UVB辐照仪为德国Waldmann Medizintechnik公司生产,辐射波长为280～320 nm,工作强度为1.35 mW/cm2。3111型细胞培养箱购于美国热电公司;BD FACSCanto Ⅱ型流式细胞仪购于美国BD FACScan 公司;SpectraMax250酶标仪购于美国Molecular Devices公司。

1.3实验方法

1.3.1细胞存活率检测 实验设正常对照组、1.0 μmol/L蜕皮甾酮组、1.5 μmol/L蜕皮甾酮组、2.0 μmol/L蜕皮甾酮组。将 HaCaT细胞、B16F10细胞和HDF细胞以1×105/L的密度接种于96孔板中,待细胞生长至80%融合时,蜕皮甾酮各组加入相应浓度的蜕皮甾酮处理24 h。然后每孔加入10 μL MTT孵育液培养3 h,弃去上清,加入100 μL MTT终止液(10%十二烷基硫酸钠、10%盐酸),8 h后在570 nm处使用紫外分光光度计测量吸光度。

1.3.2细胞凋亡检测 实验设正常对照组、UVB组、1.0 μmol/L 蜕皮甾酮组、1.5 μmol/L蜕皮甾酮组、2.0 μmol/L蜕皮甾酮组。将HaCaT细胞以1×105/L的密度接种于96孔板中,待细胞生长至80%融合时,蜕皮甾酮各组加入相应浓度的蜕皮甾酮处理24 h。打开平皿盖,除正常对照组外,其余组均在避光暗处进行UVB照射(30 mJ/cm2),然后加入完全培养液,于培养箱中继续培养6 h。各组HaCaT细胞处理后,消化,洗涤,收集细胞,制备细胞悬液,冰浴避光中操作:采用结合缓冲液悬浮细胞,使其密度为 5×104/L,加入 Annexin-FITC和PI,共同孵育15 min染色,1 h内流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3.3细胞凋亡形态观察 收集处理后的HaCaT细胞,消化,洗涤,制备细胞悬液,密度为1×109/L,接种于培养瓶中,实验分组及HaCaT细胞培养同1.3.2,UVB照射处理后,加入完全培养液,于培养箱中继续培养6 h,收集细胞并洗涤,4%多聚甲醛溶液固定后,PBS洗涤,Hoechst33258染色15 min,采用荧光显微镜观察细胞形态,并照相保存。

1.3.4HaCaT细胞中MMP-1、MMP-9、COX-2、Sirt-1蛋白表达Western blot检测 实验分组及细胞培养,处理同1.3.2。收集各组处理后的细胞,PBS 洗涤,冰上裂解 30 min,裂解后提取总蛋白,BCA 检测试剂盒测定蛋白浓度。用10% SDS-PAGE分离蛋白并转移到PVDF膜上,PBS洗膜,5%脱脂牛奶在室温下封闭1 h。在4 ℃下用一抗孵育过夜,随后用PBS洗涤膜3次,加入HRP结合的二抗在室温下孵育2 h;洗膜;使用化学发光凝胶成像系统显示蛋白质条带,然后使用Image Pro Plus 6.0软件进行定量分析。

1.3.5HaCaT细胞中HAS-2、TGM1和HDF细胞中COL1A1蛋白表达Western blot检测 实验设正常对照组、1.0 μmol/L蜕皮甾酮组、1.5 μmol/L蜕皮甾酮组、2.0 μmol/L蜕皮甾酮组。分别将HaCaT细胞、HDF细胞以1×105/L的密度接种于96孔板中,待细胞生长至80%融合时,蜕皮甾酮各组加入相应浓度的蜕皮甾酮处理24 h。收集各组细胞,按照1.3.4中方法检测HAS-2、TGM1和COL1A1蛋白表达情况。

1.3.6黑色素生成和分泌测定 实验设正常对照组、黑色细胞刺激素组、1.0 μmol/L 蜕皮甾酮组、1.5 μmol/L蜕皮甾酮组、2.0 μmol/L蜕皮甾酮组、熊果苷组。将B16F10细胞0.5×105/孔接种于12孔板中,加入培养基,在加湿的5%CO2培养箱中,孵育12 h,更换培养基后,正常对照组:正常培养;黑色细胞刺激素组加入100 nmol/L α-MSH;1.0 μmol/L蜕皮甾酮组加入1.0μmol/L 蜕皮甾酮+100nmol/Lα-MSH;1.5 μmol/L 蜕皮甾酮组加入1.5 μmol/L蜕皮甾酮+100 nmol/L α-MSH;2.0 μmol/L蜕皮甾酮组加入2.0 μmol/L蜕皮甾酮+ 100 nmol/L α-MSH ;熊果苷组加入1 mmol/L熊果苷+100 nmol/L α-MSH ,处理B16F10细胞48 h。黑色素分泌情况测定方法:使用Spectramax 250微孔板读取器,在475 nm处测量细胞培养基的吸光度值。黑色素生成情况测定方法:用冷PBS洗涤细胞并收获细胞,用20 mL细胞裂解缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、20 mmol/L NaF、25 mmol/L β-甘油磷酸pH 7.5、120 mmol/L NaCl、2%NP-40和蒸馏水)裂解细胞,并在12 000 r/min下离心10 min。去除上清液,将颗粒溶解在100 μL 1 mol/L NaOH(含有10%二甲基亚砜)中,60 ℃持续30 min,使用Spectramax 250微孔板读取器,在405 nm处测量吸光度值。

1.3.7酪氨酸酶活力测定 实验设正常对照组、左旋多巴组、1.0 μmol/L 蜕皮甾酮组、1.5 μmol/L蜕皮甾酮组、2.0 μmol/L蜕皮甾酮组。在加湿的5%CO2培养箱中,蜕皮甾酮各组将蘑菇酪氨酸酶(100 IU/mL)与相应浓度蜕皮甾酮共同孵育30 min,然后除正常对照组外,其余组均加入左旋多巴(2 mmol/L)处理5 min。使用SpectraMax 250微板读取器测量混合物在475 nm处的吸光度值即为酪氨酸酶活性。

2 结 果

2.1各组HaCaT细胞、B16F10细胞、HDF细胞增殖存活率比较 HaCaT细胞存活率分别为(97.74±2.36)%、(98.50±2.18)%、(97.89±1.89)%、(97.40±1.89)%,B16F10细胞存活率分别为(98.36±2.19)%、(98.18±1.57)%、(97.53±2.38)%、(97.34±0.90)%,HDF细胞存活率分别为(98.52±2.12)%、(97.94±2.26)%、(96.63±2.13)%、(96.55±1.84)%,各组间各细胞存活率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。因此选定1.0 μmol/L、1.5 μmol/L、2.0 μmol/L蜕皮甾酮进行后续实验。

2.2各组HaCaT细胞凋亡情况及形态比较 UVB组细胞凋亡率明显高于正常对照组(P<0.05);蜕皮甾酮各组细胞凋亡率均明显低于UVB组(P均<0.05);蜕皮甾酮各组间细胞凋亡率呈浓度依赖性降低,组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。Hoechst33258染色显示正常对照组HaCaT细胞大而饱满,呈均匀蓝色荧光;UVB组HaCaT细胞变小,胞核皱缩、碎裂,染色质浓缩,聚集在核膜边缘,出现典型的凋亡形态;蜕皮甾酮各组随着蜕皮甾酮浓度增高,HaCaT细胞凋亡形态明显减少。见图1。

1为正常对照组;2为UVB组;3为1.0 μmol/L 蜕皮甾酮组;4为1.5 μmol/L蜕皮甾酮组;5 为2.0 μmol/L蜕皮甾酮组图1 正常对照组和 UVB辐射各组HaCaT细胞凋亡情况

2.3各组HaCaT细胞中MMP-1、MMP-9、COX-2、Sirt-1蛋白表达情况比较 与正常对照组比较,UVB组HaCaT细胞中MMP-1、MMP-9、COX-2蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),Sirt-1蛋白相对表达量明显降低(P均<0.05);与UVB组比较,蜕皮甾酮各组 HaCaT细胞中MMP-1、MMP-9、COX-2蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),Sirt-1蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05);蜕皮甾酮各组间MMP-1、MMP-9、COX-2、Sirt-1蛋白相对表达量呈浓度依赖性升高或降低,组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图2。

1为正常对照组;2为UVB组;3为1.0 μmol/L 蜕皮甾酮组;4为1.5 μmol/L蜕皮甾酮组;5 为2.0 μmol/L蜕皮甾酮组图2 正常对照组和 UVB辐射各组HaCaT细胞中光老化相关蛋白表达情况

2.4各组HaCaT细胞中HAS-2、TGM1蛋白和HDF细胞中COL1A1蛋白表达情况比较 蜕皮甾酮各组HaCaT细胞中HAS-2、TGM1蛋白相对表达量和HDF细胞中COL1A1蛋白相对表达量均明显高于正常对照组,且蜕皮甾酮各组间HaCaT细胞中HAS-2、TGM1蛋白相对表达量和HDF细胞中COL1A1蛋白相对表达量均呈浓度依赖性升高,组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图3。

1为正常对照组;2为1.0 μmol/L 蜕皮甾酮组;3为1.5 μmol/L蜕皮甾酮组;4 为2.0 μmol/L蜕皮甾酮组图3 正常对照组和蜕皮甾酮各组HaCaT细胞中保湿相关蛋白和HDF细胞中胶原生成相关蛋白表达情况

2.5各组B16F10细胞黑色素生成、分泌情况比较黑色细胞刺激素组B16F10细胞黑色素生成和分泌吸光度值均明显高于正常对照组(P均<0.05),蜕皮甾酮各组和熊果苷组B16F10细胞黑色素生成和分泌吸光度值均明显低于黑色细胞刺激素组(P均<0.05)。见图4。

1为正常对照组;2为黑色细胞刺激素组;3为1.0 μmol/L 蜕皮甾酮组;4为1.5 μmol/L蜕皮甾酮组;5 为2.0 μmol/L蜕皮甾酮组;6为熊果苷组图4 正常对照组和黑色细胞刺激素各组B16F10细胞黑色素生成、分泌情况

2.6各组蘑菇酪氨酸酶活性比较 左旋多巴组蘑菇酪氨酸酶活性明显高于正常对照组(P<0.05),蜕皮甾酮各组蘑菇酪氨酸酶活性均明显低于左旋多巴组(P均<0.05)。见图5。

1为正常对照组;2为左旋多巴组;3为1.0 μmol/L 蜕皮甾酮组;4为1.5 μmol/L蜕皮甾酮组;5 为2.0 μmol/L蜕皮甾酮组图5 正常对照组和左旋多巴各组蘑菇酪氨酸酶活性

3 讨 论

蜕皮甾酮是一种天然存在的类固醇,具有抗内毒素[7]、调节糖脂代谢[8]、改善心肌缺血[9]、保护血管内皮[10]等多种作用,在医疗保健领域已得到广泛应用。胡惠清等[11]研究表明,蜕皮甾酮能显著抑制紫外线辐射后HaCaT细胞中MMP-l和MMP-9蛋白的表达。紫外线辐射在皮肤光老化和黑色素生成中发挥着重要作用[12],据此推测蜕皮甾酮具有抗皮肤光老化作用,为了进行验证,笔者进行了相关研究。

MMPs作为一类作用广泛的间质胶原酶,对真皮的Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维有明显降解作用[13],与皮肤光老化密切相关。COX-2在光老化的发生发展中发挥重要作用,光老化皮损中COX-2的表达明显增高[14]。Sirt-1 是皮肤衰老表观修饰的一个重要调控靶点,光老化皮损中Sirt-1的表达明显降低[15]。此外,保持充足的皮肤水化和生成新的胶原蛋白是维持健康皮肤的重要过程,相关研究显示保湿相关蛋白如HAS-2和TGM1[16]、胶原蛋白COL1A1在光老化皮损中表达显著减少[17]。本实验结果显示,在所选浓度内,蜕皮甾酮对HaCaT细胞、B16F10细胞和HDF细胞的增殖无明显影响,提示蜕皮甾酮细胞毒作用较弱。细胞凋亡及蛋白表达检测显示,蜕皮甾酮可明显抑制UVB辐射后HaCaT细胞的凋亡及MMP-1、MMP-9、COX-2的表达,促进UVB辐射后HaCaT细胞中Sirt-1 的表达,且蜕皮甾酮能显著促进HaCaT细胞中保湿相关蛋白HAS-2、TGM1和HDF细胞中胶原蛋白COL1A1的表达,说明蜕皮甾酮对UVB辐射引起的角质形成细胞炎症及光老化有明显抑制作用,并可影响保湿相关蛋白、胶原蛋白的表达,具有保护皮肤作用。

尽管黑色素在保护皮肤免受紫外线辐射方面有重要作用,但大多数人群更喜欢使皮肤变亮变白,故如何抑制黑色素产生也是重点研究问题。本研究采用B16F10细胞检测了蜕皮甾酮对黑色素产生和分泌的影响,结果显示蜕皮甾酮能显著减少α-MSH作用下B16F10细胞黑色素产生和分泌。蘑菇酪氨酸酶是最常作为人类酪氨酸酶的药理检测模型,它与哺乳动物酪氨酸酶具有高度的同源性[18]。故本研究还观察了蜕皮甾酮对蘑菇酪氨酸酶活力的影响,结果显示蜕皮甾酮能显著抑制蘑菇酪氨酸酶的活性。上述结果证实蜕皮甾酮能减少黑色素生成,具有一定的减少色沉作用。

综上所述,蜕皮甾酮具有抗光老化、保湿和抗黑素生成活性,可以被认为是一种良好的延缓皮肤衰老的候选药物,但其抗光老化、保湿、抗黑素生成的分子机制有待进一步研究明确。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。