基于TLR-NF-κB通路探讨如意金黄散对大鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染创面炎症的影响

刘现周,戴 睿,徐 强

(1. 天津中医药大学第二附属医院,天津 300250;2. 天津中医药大学,天津 301617)

在人类伤口愈合的过程中,伤口微环境中的真菌、细菌和病毒在内的一系列因素在该过程中起到了非常重要的作用,其中细菌的作用最为突出。金黄色葡萄球菌是医院和社区感染的主要病原菌之一,可以影响血液、皮肤和软组织以及下呼吸道共生菌[1],在软组织感染中检出率极高。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为多重耐药菌,近年来研究显示其已成为院内感染致死的首要病原菌[2]。中药的优势体现于能够在不使得细菌产生更强的耐药性的情况下起到对创面的治疗作用,避免外用抗生素所致细菌更强耐药性的恶性循环,为临床感染性创面体外用抗生素导致高耐药菌产生的难题提供新的解决思路。 目前有研究表明,如意金黄散具有抑菌、抗炎、止痛等作用,对常见的致病菌如金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌有一定抑制作用,可用于治疗体表化脓性感染[3-4]。用时根据局部阴阳辨证以香油、茶、葱汁及酒调敷于患处,可起到箍集围聚、收束疮毒的作用,与75%酒精制备成酊剂之后能发挥其透皮吸收的作用[5]。本实验探讨了如意金黄散对MRSA感染创面愈合情况、炎症因子Toll样受体(TLR)-核因子κB(NF-κB)通路相关受体的影响,以期深入研究外用中成药复方抗菌活性的作用机制,为中药相关抗耐药菌的新剂型的研发提供新的思路。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级6～8周龄SD健康雌性大鼠41只,体重(280±20)g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,许可证号:SCXIK(京)2019-0010。将大鼠饲养于中国医学科学院放射医学研究所清洁级动物房,适应性喂养1周,室温20～25 ℃,湿度50%～65%,在12 h光照、12 h黑暗的环境中,自由进食和饮水。所有实验操作符合科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2药物 如意金黄散(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂,国药准字Z11020906,规格:12 g/袋),临用前与75%酒精制成酊剂;莫匹罗星软膏(澳美制药,国药准字HC20160015);生理盐水(成都青山利康药业有限公司,国药准字H20044562)。

1.3试剂与仪器 冰乙酸(CH3COOH,天津市江天化工技术有限公司),MRSA(宁波明周生物,菌种编号:B80950,-80 ℃储存),异氟烷(型号:R510-22),MRSA 显色培养基(法国科玛嘉,货号:MR500),MH琼脂(杭州微生物,批号:202012090),无菌脱纤维羊血(杭州新锐生物,批号:20210406),MRSA筛选琼脂基础(青岛日水生物,货号:10833),大鼠白细胞介素-10(IL-10)、大鼠白细胞介素-6(IL-6)、大鼠核因子-κB p65(NF-κB p65)ELISA试剂盒(中国江莱生物公司,货号分别为JL20896,JL13427,JL45112),TRIzol(Thermo,货号:YZ-15596026),氯仿(天津化学试剂有限公司,货号:20201003),异丙醇、酒精(天津市富宇精细化工有限公司,货号分别为20190522,20200627),反转录试剂盒(Thermo,货号:K1622),qPCR试剂盒(Takara,货号:DRR039A);双人双面超净台(中国苏州净化设备)、加热磁力搅拌器(德国IKA)、高性能通用台式离心机(美国THERMO)、超微量分光光度计(中国杭州奥盛仪器NANO300),涡旋振荡器(德国IKA)、灭菌器(中国上海博讯)、组织研磨机(中国鼎昊源科技)、二氧化碳培养箱(中国香港康力)、ELISA洗板机(Thermo 888)、孵箱(Thermo D401)、手持均质仪 (杭州米欧仪器MT-13K-L)、恒温摇床(苏州捷美电子有限公司NS-13U)、低温高速离心机(Eppendorf5415R)、PCR仪(BioradC1000)均由中国医学科学院放射医学研究所实验动物仪器中心提供。

1.4药物、培养基及细菌制备方法

1.4.1金黄散酊制备方法 取药粉,按1∶8的比例溶于75%酒精内浸泡48 h,分2次回流提取,每次2～3 h,滤过残渣收集提取液即成。药液回收率≥75%,生药含量约12.5%。

1.4.2LB液体培养基制备方法 称取胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化钠10 g、培养粉2 g于1 L蒸馏水中,混悬至完全溶解,121 ℃高压灭菌15 min,放置在4 ℃冰箱中备用。

1.4.3LB固体培养板制备方法 称取胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化钠10 g、琼脂粉2 g于1 L蒸馏水中,混悬至完全溶解,121 ℃高压灭菌15 min,灭菌结束后摇匀,以防琼脂沉积于器皿底部而凝固,放置在50 ℃水浴中,倒平板,晾干后用保鲜膜封口,放置在4 ℃冰箱中备用。

1.4.4MRSA显色培养平板制备方法 称取瓶内干粉8.25 g于100 mL蒸馏水中,混悬至完全溶解。在微波炉中加热,煮沸后混合物立即移出微波炉并轻轻搅拌,而后移入微波炉再加热,直至琼脂完全溶解(大量气泡代替泡沫产生,大约需要2 min)。取增补剂溶于1 mL无菌水中,轻轻混匀。将增补剂100 μL加入冷却至50 ℃的基础培养基中,轻轻摇匀。倒平板,晾干后用保鲜膜封口,放置在4 ℃冰箱中备用。

1.4.5MH羊血培养平板制备方法 称取MH培养粉38 g于1 L蒸馏水中,混悬至完全溶解。121 ℃高压灭菌15 min,灭菌结束后摇匀,以防琼脂沉积于器皿底部而凝固。放置在50 ℃水浴中,加入50 mL提前预热至37 ℃的无菌脱纤维羊血,混匀。倒平板,晾干后用保鲜膜封口,放置在4 ℃冰箱中备用。

1.4.6细菌制备方法 从-80 ℃冰箱中取出细菌冻存管,用无菌1 μL接种环取细菌涂在MRSA抗生素筛选培养平板上,37 ℃培养箱培养24 h,用无菌1 μL接种环刮取细菌,溶解于无菌PBS中制备细菌悬液。

1.5实验方法 采用随机数字表法将大鼠随机分为4组,采用异氟烷麻醉各组大鼠,在大鼠背部两侧剃毛,然后应用安吉尔剃须刀片刮除待手术区域的毛发,常规消毒,在无菌条件下于大鼠背部用外科方法自腰背部脊柱两侧制作4个圆形溃疡创面,标记为1,2,3,4号,暴露浅筋膜。然后应用微量移液器取25%的冰醋酸50 μL 滴到浅筋膜上,按照溃疡面面积准备细菌悬液(细菌浓度1.25×109),造成大鼠MRSA感染创面。各组于造模后次日开始换药,换药前碘伏常规消毒创面,生理盐水组10只采用生理盐水换药,75%酒精组10只采用75%酒精换药,莫匹罗星组10只采用莫匹罗星换药,金黄散酊组11只采用金黄散酊换药,均每日1次,药量均为0.4 g/cm2。

1.6检测指标及方法

1.6.1创面面积 分别于治疗第1天、第3天、第7天、第14天使用Image J软件测量各组4号创面面积。

1.6.2菌落计数 分别于治疗第1天、第3天、第7天、第14天取各组大鼠1,2,3,4号创面组织,每组取部分肉芽组织,加入1 mL无菌PBS,经匀浆、离心、稀释后,取10 μL菌液分别接种至MH血平板、MRSA显色平板,37 ℃培养24 h后拍照、计数。

1.6.3肉芽组织蛋白上清中NF-κB p65、IL-6、IL-10含量 取各组大鼠治疗第1天、第3天、第7天、第14天的部分肉芽组织,按照ELISA试剂盒说明操作,经加样、温育、配液、洗涤、加酶、温育、洗涤显色、终止后,应用酶标仪,白孔调零450 nm波长依序测各孔的OD值。

1.6.4肉芽组织中1-TLR2、1-TLR4 mRNA表达情况 采用RT-PCR法检测: 取各组大鼠治疗第7天冷冻保存的肉芽组织100 mg,根据TRIzol试剂盒说明书提取肉芽组织总RNA,并检测总RNA的纯度及浓度,以总RNA为模板,反转录得到cRNA。采用SYBR Premix Ex TaqTM配制反应体系,取1 μL cDNA,加入9 μL反应体系中(2 μL SYBR,上、下游引物各1 μL,纯水加至10 μL);PCR反应程序:预变性95 ℃ 10 s;PCR扩增:95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,扩增40个循环;溶解曲线分析,监控PCR反应特异性:95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,95 ℃ 15 s。以β-actin为内参,采用2-ΔΔCT法计算相对表达量。引物序列见表1。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况 在实验第8天,金黄散酊组有1只大鼠死亡;在实验第14天,生理盐水组有1只大鼠死亡;其他时间及组别均无大鼠死亡,未发现其他染情况出现。

2.2各组不同时期MH羊血琼脂培养平板中菌落计数 治疗第3天,莫匹罗星组菌落计数明显低于生理盐水组和75%酒精组(P均<0.05),金黄散酊组明显低于生理盐水组(P<0.05),莫匹罗星组与金黄散酊组比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗第7天,各组菌落计数比较差异均无统计学意义(P均>0.05);治疗第14天,金黄散酊组菌落计数明显低于生理盐水组(P<0.05)。见图1。

图1 不同时间段各组感染创面中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在MH羊血琼脂培养基中的菌落计数

2.3各组不同时期MRSA显色培养基平板中菌落计数 治疗第3天,莫匹罗星组菌落计数明显低于其他3组(P均<0.05);治疗第7天,莫匹罗星组菌落计数仍然明显低于其他3组(P均<0.05),金黄散酊组明显低于75%酒精组(P<0.05); 治疗第14天,莫匹罗星组菌落计数明显低于75%酒精组与金黄散酊组(P均<0.05)。见图2。

图2 不同时间段各组感染创面中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在MRSA显色培养基中的菌落计数

2.4各组肉芽组织蛋白上清中NF-κB p65、IL-6、IL-10含量 治疗第3天:金黄散酊组NF-κB p65含量明显高于75%酒精组(P<0.05),IL-6含量明显低于莫匹罗星组(P<0.05),各组间IL-10含量比较差异均无统计学意义(P均>0.05);治疗第7天:各组间NF-κB p65、IL-6含量比较差异均无统计学意义(P均>0.05),金黄散酊组IL-10含量明显高于生理盐水组及75%酒精组(P均<0.05),莫匹罗星组IL-10含量明显高于生理盐水组(P<0.05);治疗第14天,各组间NF-κBp65、IL-6含量比较差异均无统计学意义(P均>0.05),金黄散酊组和莫匹罗星组IL-10含量均明显高于生理盐水组及75%酒精组(P均<0.05)。见图3。

图3 不同时间段各组大鼠感染创面肉芽组织蛋白上清中NF-κB p65、IL-6、IL-10含量

2.5各组肉芽组织中1-TLR2、1-TLR4 mRNA相对表达量 治疗第7天,莫匹罗星组和金黄散酊组1-TLR2、1-TLR4 mRNA相对表达量均明显低于生理盐水组(P均<0.05),且金黄散酊组1-TLR2、1-TLR4 mRNA相对表达量均明显低于75%酒精组(P均<0.05)。见表2。

表2 治疗第7天各组大鼠肉芽组织中1-TLR2、1-TLR4 mRNA相对表达量比较

3 讨 论

细菌感染和耐药均是群体行为,细菌之间可以通过某些化学信号分子进行信息的传递[6],而中药对细菌之间信号传递作用的影响研究甚少。中药制剂如意金黄散具有抗菌消炎作用,可促进感染伤口愈合。在剂型方面,传统赋形剂主要为蜂蜜、醋、葱汁等,而目前又出现了以如意金黄散为底方的膜剂、乳膏剂、巴布剂等,但在临床中较为常用的为酊剂。中药酊剂系指药材用规定浓度的乙醇提取或溶解而制成的澄清液体制剂,具有促进透皮吸收的作用[7]。如意金黄散出自明朝陈实功《外科正宗》,具有清热除湿、散结化痰、消肿止痛的功效。本方的君药为大黄、黄柏,利用其苦寒之性清热解毒;厚朴、天南星、陈皮燥湿化痰行气,为臣药;姜黄破血行气,为佐药;天花粉、甘草、白芷为使,清热消肿,调和诸药。如意金黄散中的主要药效成分之一大黄素可以显著干扰S.aureus胞外脱氧核糖核酸(DNA)的释放,并抑制生物膜相关基因cidA、icaA、sarA、dltB和agrA的表达[8]。孙广等[9]研究了29种中药提取物对MRSA的抑菌作用,发现黄柏的抑菌作用最强,其次是甘草、黄芩,且推测对MRSA抑制作用较强的有效成分可能为脂溶性成分,建议在进行有效成分研究中应充分考虑提取溶剂的极性。本实验建立大鼠MASA感染创面,体外抑菌实验结果显示金黄散酊组复合菌种培养基(羊血琼脂培养平板)中菌落计数较其他组明显降低,而莫匹罗星组MRSA单一菌种培养基(MRSA显色培养基)中菌落计数较其他组明显降低,说明如意金黄散酊剂对MRSA及其他菌种共存的创面抑菌作用较为明显。本研究结果与孙广等[9]研究结果可相互呼应、论证。

影响伤口愈合的因素主要分成两大类:一类是炎症期创面免疫细胞的异常活跃,在炎症因子的作用下,创面长期处于炎症状态而无法愈合;另一类是因为创面营养状况较差或蛋白酶的异常激活,导致创面生长因子缺乏、成纤维细胞及表皮细胞扩增受限,最终造成创面不愈合[10]。TLR/NF-κB通路与机体的自身免疫相关,是炎症反应时机体产生免疫应答和炎症反应的关键信号系统[11]。当机体受到严重创伤或细菌感染后,会释放大量的肿瘤坏死因子-α(TNF-α),TNF-α与TLR结合[12]。TLR激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)[13],TRAF6被激活后可降解NF-κB抑制蛋白(IκB)[14],使NF-κB的静息状态得以解除,NF-κB转入细胞核中诱导特定基因的表达。NF-κB活化后可以增强TNF-α、IL-1等细胞因子的基因转录,使其产生和释放增多,其正反馈效应使NF-κB 继续增多,出现炎症瀑布样级联反应,促使IL-6产生和释放,同时产生的IL-10可抑制NF-κB活化[15-16]。IL-6是一种具有冗余和多效性活性的细胞因子[17],可调节免疫反应、造血、急性期反应和炎症反应[18]。当感染或损伤引起组织炎症发生时,机体迅速诱导IL-6合成,其通过刺激急性期免疫反应和造血有助于宿主防御,当组织稳态恢复时,其产生终止[19]。IL-10由几乎所有白细胞产生,包括巨噬细胞、树突状细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、B细胞和许多CD4T细胞亚群,释放抗炎性因子,抑制单核巨嗜细胞释放炎症介质[20]。本实验结果显示,治疗第3天,金黄散酊组NF-κB p65含量明显高于75%酒精组,IL-6含量明显低于莫匹罗星组;治疗第7天和第14天,金黄散酊组和莫匹罗星组IL-10含量均明显高于生理盐水组。提示如意金黄散酊剂具有减轻MRSA感染创面炎症反应作用。

TLRs是天然免疫系统中一个极其重要的家族,在免疫应答中发挥着重要的作用,但是对于抗细菌感染中起着核心作用的主要是TLR2和TLR4[21]。研究发现,TLR4是脂多糖(LPS)的主要识别受体,LPS是革兰阴性细菌外膜的共同成分,具有很强的刺激免疫能力,TLR4将LPS信号通过细胞内TRAF、IRAK等下游分子向下传导,最终活化NF-κB和MAPK通路,导致大量前炎症因子表达;TLR2是革兰阳性细菌脂蛋白的主要识别受体,TLR2被脂膜酸激活可在人未成熟的树突状细胞引起前炎症细胞因子的分泌[22]。本实验结果显示,金黄散酊组1-TLR2、1-TLR4 mRNA相对表达量均明显低于生理盐水组及75%酒精组,提示如意金黄散酊剂可抑制TLR-NF-κB通路的1-TLR2、1-TLR4受体,从而导致前炎症反应。

综上所述,如意金黄散酊剂可减轻MRSA感染创面炎症反应,而在临床实践过程中,伤口感染往往是多个菌种共存的状态,因此对于中药抗菌制剂而言,不应一味地追求中药针对某单一菌落的抗菌作用,而是在与伤口感染相似的环境下对复合菌种的抗感染作用,达到伤口微环境的平衡,从而促进伤口愈合。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。